科研│华中农业大学：转录组和功能分析揭示lncRNA000170在番茄多细胞毛状体形成中的调控作用（国人佳作）
编译：微科盟YQ，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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毛状体是陆生植物的附属物，根据细胞数量或分支的不同可分为不同类型。毛状体作为植物外层结构，提供物理保护，增强植物对昆虫和病原的抵抗力。由于其结构简单，它可以作为描述毛状体发育调控机制的理想模型。
拟南芥毛状体的特征是单细胞结构，启动的关键调控因子有GL1、GL3、GL3增强子（EGL3）、TTG1。GL1-GL3 / EGL3-TTG1复合物激活GL2和TTG2表达，诱导毛状体形成。MYB转录因子如CAPRICE、TRIPTYCHON、ETC1、ETC3、TCL1/2通过与GL/ EGL3结合形成失活复合体，抑制邻近的毛状体细胞命运。C2H2锌指转录因子也调控拟南芥毛状体的形成，如GIS / GIS2 / GIS3、锌指蛋白ZFP5 / ZFP6 / ZFP8。毛状体初始化过程中，GIS、ZFP5、ZFP6是GL1-GL3/EGL3-TTG1复合体的转录激活因子，GIS可能在毛状体形成过程中受TCL1调控。
番茄的毛状体有7种。其中I型、IV型、VI型和VII型是腺毛状体，它们产生不同的代谢产物。bHLH转录因子SlMYC1参与VI型毛状体形态发生。JAI1通过茉莉酸受体功能调节VI型毛状体及其代谢产物浓度。查尔酮异构酶是类黄酮生物合成的关键酶，也参与VI型毛状体形成。编码B型细胞周期蛋白的SlCycB2及其同系物SlCycB3可能促进G2/M转化，在I型毛状体的启动中发挥重要作用。Woolly（Wo）是一种HD-Zip IV蛋白，与C2H2锌指蛋白相互作用，是腺毛状体初始化的正向调节因子。
长链非编码RNA（lncRNA）广泛存在于动植物中，长度超过200个核苷酸的lncRNA根据其基因组区域可分为基因间RNA、反义RNA、内含子RNA。例如，反义COOLAIR在春化过程中抑制FLC基因转录，玉米Zm401主要在绒毡层和小孢子中表达，番茄lncRNA16397通过减少活性氧积累增强对致病疫霉的抗性。敲除lncRNA1459的番茄的成熟过程显著抑制。S-slylnc0957的下调表达增强番茄植株对TYLCV的抗性。lncRNA参与花期控制、缺磷响应、果实成熟和害虫防御，而lncRNA是否参与毛状体形成仍不清楚。
本研究利用转录组分析鉴定woolly突变体LA3560的差异表达lncRNA。转基因实验表明，lncRNA000170的过表达抑制I型毛状体的形成，进一步确定lncRNA000170是Solyc10g006360的反义转录本，表明lncRNA000170在番茄毛状体的形成中起重要作用。
论文ID
原名：Transcriptomic and functional analyses uncover the regulatory role of lncRNA000170 in tomato multicellular trichome formation
译名：转录组和功能分析揭示lncRNA000170在番茄多细胞毛状体形成中的调控作用
期刊：the Plant Journal
IF：6.141
发表时间：2020年6月
通讯作者：杨长宪
通讯作者单位：华中农业大学园艺林学学院
DOI号：10.1111/tpj.14902
实验设计
结果
1 差异表达基因（DEG）
研究表明Wo位点有4个等位基因，包括Wo、Wom、Womz和Wov。Wo突变体LA3560中的等位基因Wov诱导了高毛状体密度。本研究利用LA3560（Wo）和野生型（WT）幼茎样本进行RNA-Seq。基于番茄参考基因组，共鉴定24824个表达基因。24824个表达基因中有22698个在Wo和WT中共表达，Wo和WT中分别有627和1010个基因特异表达（图1a）。Wo相比WT共有4643个基因差异表达，包括2921个上调基因和1722个下调基因（图1）。
图1. 番茄lncRNA的鉴定与分类。a：Wo和WT中表达的mRNA、lncRNA和TUCPs（未知功能的转录本）；b：Wo中上调和下调的mRNA、lncRNA和TUCPs数量。
2 lncRNA鉴定
研究表明lncRNA的长度超过200个核苷酸。使用CUFFCOMPARE将lncRNA转录本与已知的蛋白编码转录本比较，获得了2356个转录本。转录本编码潜力通过toils编码潜力计算器CPC和PFAM-SCAN进行评估，获得不确定编码潜力转录本（TUCPs）。共有1054个转录本是TUCPs，以及1303个lncRNA。
使用CIRCOS对染色体上lncRNA的分布进行研究。结果表明这些lncRNA在常染色质区域的密度更高（图2a）。在基因组区域获得1132个（86.9%）基因间lncRNA和171个（13.1%）反义lncRNA。lncRNA转录本长度为202 - 14708个核苷酸，平均1316个核苷酸（图2c）。约19%的lncRNA和35%的TUCPs大于2000个核苷酸。约84%的lncRNA和约58%的TUCPs含有1-2个外显子（图2d）。此外，lncRNA和TUCPs在番茄中的表达水平低于蛋白编码基因（图2b）。
3 预测miRNA和lncRNA之间的相互作用
前期研究表明lncRNA可以被miRNA靶向。miRNAs和lncRNAs之间的相互作用在lncRNA介导的发育和应激过程中发挥关键作用。使用PSMIMIC和PSROBOT确定了20个lncRNA作为12个已知miRNA的靶标。在这些miRNA靶标中，lncRNA000551是对番茄果实萜类积累至关重要的slymiR1917的靶标。lncRNA000436是slymiR1918的靶标，可以增强番茄对致病疫霉的敏感性。lncRNA000311是slymiR390a-5p的靶标，感染黄瓜绿斑纹花叶病毒可诱导其表达。lncRNA000029是参与低温胁迫响应的slymiR397的靶标。有趣的是，slymiR5303靶向多种lncRNAs，包括lncRNA000032、lncRNA000103、lncRNA000104、lncRNA00 0105、lncRNA000106、lncRNA000170、lncRNA000423、lncRNA000798和lncRNA001296。
4 差异表达lncRNA的功能分析
lncRNA可通过调节相邻的蛋白编码基因发挥作用。共表达分析表明，共有2825个蛋白编码基因可能与差异表达lncRNA相关。经过筛选共检测到425个与lncRNA共表达的差异表达基因。为揭示差异表达lncRNA的潜在作用，GO富集显示的分子功能主要类别是“转录因子活性”，细胞成分的“质膜”，其次是“细胞壁”，以及参与“真菌防御反应”的生物过程。
5 毛状体中高表达的lncRNA鉴定
既往研究表明，与WT相比，Wo基因导致明显的羊毛表型。分析Wo和WT的lncRNA表达水平，发现有196个lncRNA差异表达。在Wo中，196个lncRNA中有86个上调，110个下调。毛状体相关的lncRNA可能在毛状体中高表达。进一步检测从LA3560刮取茎毛状体和无毛状体中这些lncRNA的表达水平，多数lncRNA转录本在毛状体中高表达（图3）。在不同组织中，包括茎毛状体（TRI）、根（R）、茎（S）、叶（L）、花（FL）和果实（FR），lncRNA000746、lncRNA000170、lncRNA000277、lncRNA000774、lncRNA000756、lncRNA000100和lncRNA000898这7个lncRNA在茎毛状体中的表达水平较高，这些lncRNA可能与毛状体的形成密切相关。
图3. LA3560茎毛状体（TRI）和无毛状体（TFS）中上调的lncRNA的qPCR分析。
6 毛状体相关lncRNA的功能表征
lncRNA000746、lncRNA000170、lncRNA000277、lncRNA000774、lncRNA000756、lncRNA000100和lncRNA000898这7个lncRNA分别包含2257 bp、899 bp、2019 bp、588 bp、548 bp、1266 bp、1748 bp，从LA3560茎毛状体中克隆。将这7个lncRNA置于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子下构建过表达载体。通过农杆菌介导的转化，将这些载体导入突变体LA3186中。与LA3186植株相比，过表达lncRNA000170的转基因植株的I型毛状体密度明显降低（图4）。此外，体视显微镜观察显示I型毛状体明显减少，表明lncRNA000170主要调控I型毛状体的形成。而在过表达其余6个lncRNA的转基因植株中，未见明显表型变化。
7 Solyc10g006360是lncRNA000170的靶标，参与毛状体形成
为揭示lncRNA000170在毛状体形成过程中的调控作用，研究者挖掘其共表达的蛋白编码基因，发现lncRNA000170是从Solyc10g006360的互补链转录而来。因此lncRNA000170属于反义转录本（图5a）。序列比对显示，它们包含715 bp的重叠端。Solyc10g006360编码一种未知蛋白，包含166个氨基酸。在过表达lncRNA000170的转基因株系中，Solyc10g006360的表达量显著升高（图4b）。与lncRNA000170相似，Solyc10g006360在茎毛状体中高表达（图5c）。与WT相比，lncRNA000170和Solyc10g006360在几个Wo等位突变体（LA3186、LA0258和LA1908）中均表现上调。在CaMV 35S启动子的控制下构建Solyc10g006360过表达载体，选择两个Solyc10g006360高表达量的过表达株系进行表型分析。与LA3186相比，I型毛状体明显减少。因此，lncRNA000170通过调控Solyc10g006360的表达来调控番茄毛状体的形成。
图5. Solyc10g006360的鉴定及lncRNA000170和Solyc10g006360的表达分析。a：lncRNA000170转录自Solyc10g006360互补链。它们包含715bp重叠末端。
8 lncRNA000170和毛状体调控因子的表达模式
为研究lncRNA000170的空间表达模式，利用lncRNA000170启动子驱动的GUS载体转化植株，发现GUS在嫩茎和嫩叶正面表达，且I型毛状体中观察到较高的GUS活性（图6a）。选择了几个毛状体调节因子，如Wo、H、SlCycB2和SlCycB3，检测这些基因在过表达lncRNA000170的转基因植物中的表达水平，发现其表达水平在lncRNA000170过表达系中显著下调（图6b）。表明lncRNA000170和Solyc10g006360的作用可能参与了Wo、H、SlCycB2、SlCycB3介导的调控网络。
讨论
近年来，在番茄中发现了大量lncRNA。成熟抑制剂突变体番茄果实中鉴定了3679个lncRNA，抗病和易感番茄中获得了约9880个lncRNA。本研究从woolly突变体的幼茎发现了1303个lncRNA。lncRNA在12条染色体上分布不均匀，常染色质区域的密度高于异染色质区域，大多数lncRNA从基因间隔区转录，其余的则是从反义链转录。
目前，有关番茄毛状体的关键调控因子已被确定，如SlMYC1、JAI-1、CHI1、 SlCycB2、Wo、H。而lncRNA在毛状体形成过程中的功能知之甚少。本研究发现lncRNA000170在番茄I型毛状体形成中起负调控作用。lncRNA000170过表达后，I型毛状体的密度显著降低，SlCycB2及其同源基因SlCycB3的表达下调，表明lncRNA000170参与毛状体调节因子介导的调控通路。
1 科研│VIRUSES：转录组分析研究水稻感染黑条矮缩病后lncRNA-mRNA的调控网络（国人佳作）
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