科研 |Gene：PGC-1α结合RNA全转录组分析确定与胰高血糖素代谢作用相关的基因
编译：不二，编辑：景行、江舜尧。
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过氧化物酶体增殖物激活受体γ-共激活因子1-α（PGC-1α）是一种转录共激活因子，它控制代谢/能量基因的表达，控制细胞对营养和环境适应的反应，如禁食、寒冷或运动。与其他共激活因子不同，PGC-1α包含参与RNA调控的蛋白质结构域，如丝氨酸/精氨酸（SR）和RNA识别基序（RRMs）。然而，PGC-1α的RNA靶点及其与代谢的关系尚不清楚。为了解决这个问题，研究人员在胰高血糖素诱导的原代肝细胞中进行了增强的紫外线（UV）交联和免疫沉淀以及测序（eCLIP-seq）。大部分与PGC-1α结合的RNA是与胰高血糖素和空腹反应相关的转录、信号或代谢功能相关的基因内含子序列，而不是经典的PGC-1α直接转录靶点，如OXPHOS或糖异生基因。与PGC-1α结合的RNA序列得分最高的是Foxo1、Camk1δ、Per1、Klf15、Pln4、Cluh、Trpc5、Gfra1和Slc25a25。PGC-1α的缺失降低了一部分胰高血糖素诱导的信使RNA（mRNA）转录水平。重要的是，这些基因的敲低影响了胰高血糖素依赖的葡萄糖生成，这是一种PGC-1α调节的代谢途径。这些研究表明PGC-1α与内含子RNA序列结合，其中一些控制与胰高血糖素作用相关的转录水平。
论文ID
原名：Transcriptome-wide analysis of PGC-1α–binding RNAs identifies genes linked to glucagon metabolic action
译名：PGC-1α结合RNA全转录组分析确定与胰高血糖素代谢作用相关的基因
期刊：PNAS
IF：9.412
发表时间：2020年7月
通讯作者：W. Yeo
通讯作者单位：美国丹娜法伯癌症研究所
DOI号：10.1073/pnas.2000643117
实验设计
结果
PGC-1α作为转录共激活因子，在C端包含SR和RRM结构域，这些结构域预测与RNA相互作用（图1A）。为了评估内源性PGC-1α是否确实与RNA结合，研究人员使用PBS或胰高血糖素处理3h的原代肝细胞（图1B）。细胞接受紫外线（UV）照射（254 nm，400 mJ/cm2）使蛋白质与核酸交联，然后使用PGC-1α抗体进行免疫沉淀。通过WB分析交联样品，发现PGC-1α受到胰高血糖素的强烈诱导，并且它出现在不同的分子量条带中，无论是在全细胞裂解物中还是在免疫沉淀物中（图1C）。在非交联样品中未检测到大于130kDa的高分子量PGC-1α条带。在胰高血糖素刺激和未刺激的肝细胞样本中，研究人员任意地将全细胞裂解物和免疫沉淀物的不同PGC-1α分子质量条带分为上下区域（图1C中的红框所示）。根据已发表的eCLIP（增强UV交联和免疫沉淀）方案，从与PGC-1α交联的RNA中获得互补DNA（cDNA）文库。Orange G染色表明从不同样本中生成合适的测序文库用于序列分析（图1D）。这些实验表明PGC-1α与RNA相互作用。研究人员生成了拥有生物重复的文库，每个文库的平均深度为1300万个reads（图2A）。同时，研究人员还准备了对照（每个库3000万个reads）。Reads映射到小鼠参考基因组，并进行不可复制的发现率（IDR）分析，以确定每种情况下可重复的和富集的结合位点。IDR分析在对照样品的下部和上部区域分别确定了2206个可重复和3692个富集的PGC-1α结合位点。IDR峰分别分布在659个和986个基因中。同样，在胰高血糖素处理的样本中，分别有413个和2167个位点分布在胰高血糖素处理样本的较低和较高区域的118个和716个基因中。对基因区域内结合位点（近端内含子、远端内含子、5’剪接位点和非编码外显子区域）的评估表明，PGC-1α主要存在于近端和远端内含子中（图2B），与其核定位一致。
图1. 利用seCLIP分析PGC-1α结合的RNA。（A）PGC-1α蛋白C端含有RNA识别位点。（B）使用交联和免疫沉淀检测胰高血糖素刺激后肝细胞中与PGC-1α结合的RNA。（C）免疫印迹显示了紫外交联和免疫沉淀后形成的上下PGC-1α复合物。红色标记了用于RNA测序的IP和input。（D）橘黄G染色显示了测序的文库。
在胰高血糖素处理的样本中，上、下迁移复合物的PGC-1α结合峰映射到近端内含子、远端内含子和5’剪接位点的比例存在中度差异。相比之下，与上层复合物样品相比，下层样品映射到非编码外显子区域的峰比例高出三倍多（43.8%对13.3%）（图2B）。由于一个基因可以跨多个区域结合，研究人员定义了一个结合靶点，即在给定基因内结合的基因区域。利用这一指标，测序分析确定了842个RNA靶点，其中37个靶点在胰高血糖素处理后被PGC-1α特异性富集；1100个靶点在上带结合，其中306个靶点在胰高血糖素处理后特异性富集（图2C）。有趣的是，比较PGC-1α结合的RNA与HepG2和K562人类细胞系中的223个RBP（RNA结合蛋白）之间的结合区域分布，显示出PGC-1α基因区域中RNA结合的选择性模式（图2D）。
在最显著富集的胰高血糖素依赖性RNA中，研究人员发现PGC-1α与编码转录因子KLF15、FOXO1和PER1、钙相关蛋白CAMK1δ和TRPC5、参与翻译RPL22和CLUH的蛋白质、脂滴相关蛋白PLN4、GCN5相互作用复合亚单位ATXN71、Slc转运体SLC7A2和SLC25A25（图2E）相互作用。其中一些基因以前与肝脏的空腹反应或PGC-1α代谢功能有关，例如转录因子KLF15、FOXO1和PER1。然而，PGC-1α信使RNA（mRNA）的转录靶点，包括糖异生基因或OXPHOS基因，在PGC-1α免疫沉淀中没有富集。综上所述，这些结果表明肝细胞内胰高血糖素诱导的内源性PGC-1α与RNA结合，并且这些RNA中有很大一部分是内含子序列，表明这种激素在肝脏中的代谢作用中可能具有机制性功能。
图2. PGC-1α结合的基因区域分析。（A）散点图显示重复之间PGC-1α结合转录物的reads密度的相关性。每个点代表一个转录本。（B）与PGC-1α结合基因区的RNA序列。（C）胰高血糖素刺激肝细胞可诱导特异性RNA与PGC-1α结合。（D）HepG2细胞（蓝色）和K562细胞（橙色）的103和120个RBP与PGC-1α（绿色）的结合峰分布的盒形图。（E）仅在下区和上区PGC-1α复合物中对胰高血糖素刺激作出反应时，与PGC-1α结合的基因的火山图。
2 PGC-1α增加部分胰高血糖素依赖的PGC-1α结合RNA的表达水平
为了确定PGC-1α结合的RNA序列的调节功能，研究人员测量了胰高血糖素处理后PGC-1α结合的Top RNA的转录mRNA表达水平。胰高血糖素处理后，一部分转录本增加（图3A），表明在mRNA水平上起调节作用。在胰高血糖素升高最高的转录本是Klf15和线粒体核苷酸转运体Slc25a25。接下来，研究人员研究了这些胰高血糖素诱导的mRNA转录物的表达是否依赖于PGC-1α。使用特异性小干扰RNA（siRNA）来消耗原代肝细胞中的PGC-1α（图3B）。基于它们对胰高血糖素的依赖性，研究人员选择了12个与PGC-1α结合的RNA转录本，并在PGC-1α敲低时使用qPCR对其进行量化（图3C）。在这12个转录本中，有6个在PGC-1α敲低时减少。有趣的是，与胰高血糖素诱导PGC-1α相一致，胰高血糖素调节的mRNA转录本呈现出依赖于PGC-1α表达的趋势模式，尽管也有一些例外，如Klf15是胰高血糖素诱导的但不依赖PGC-1α的，这些结果表明PGC-1α与一小部分RNA结合（大多数在内含子序列上），维持其对胰高血糖素反应的表达水平。
3 一部分胰高血糖素依赖的PGC-1α结合RNA编码调控肝葡萄糖生成的蛋白质
研究人员之前已经证明PGC-1α通过不同的转录依赖机制，包括调控糖异生基因表达和三羧酸（TCA）循环流量，在空腹和胰高血糖素响应中调控肝葡萄糖的产生。因此，研究人员测试了这些胰高血糖素诱导的RNA转录本与PGC-1α相互作用是否可以控制肝葡萄糖的产生。如前所述，先前鉴定的与此途径有关的基因，如Camk1δ和Klf15，控制着葡萄糖的输出，尽管这些检测显示了亚基依赖的特异性。其他基因，如Gfra1，是由胰高血糖素轻度诱导的，当耗尽时，只有当甘油被用作底物时，葡萄糖产量才增加（图3D）。重要的是，SLC25A25（一种线粒体核苷酸转运体）的缺乏强烈抑制了葡萄糖的产生，尤其是在胰高血糖素处理时，与所使用的糖异生底物无关（图3D）。这些实验表明，PGC-1α除了直接增加糖异生酶基因表达转录（如Pck1或G6pc）外，还与调节胰高血糖素依赖性肝葡萄糖生成的RNA转录本结合。
图3. 胰高血糖素诱导肝细胞PGC-1α结合的RNA亚群。（A）胰高血糖素刺激结合PGC-1α的RNA亚群的水平。（B）针对Ppargc1a的siRNA寡核苷酸可有效降低Ppargc1a的表达水平和PGC-1α的蛋白水平。（C）qPCR分析表明，胰高血糖素诱导的基因表达水平受PGC-1α水平的控制。（D）当丙酮酸/乳酸或甘油作为葡萄糖异生的底物时，Slc25a25的缺乏抑制肝细胞的葡萄糖释放。当以甘油为底物时，Gfra1的缺乏增加了肝细胞中葡萄糖的释放。
4 胰高血糖素依赖的PGC-1α与Slc25a25远端内含子和近外显子1亚型特异性RNA序列结合增加mRNA和蛋白质表达
基于上述结果，胰高血糖素可显著增加Slc25a25基因表达，Slc25a25转录RNA以胰高血糖素依赖的方式与PGC-1α结合，而Slc25a25是胰高血糖素对肝葡萄糖生成的作用所必需的，研究人员决定研究PGC-1α与Slc25a25 RNA的结合以及Slc25a25如何控制这种代谢途径。在胰高血糖素处理的肝细胞中，PGC-1α与Slc25a25亚型中的四个共同的远端内含子区域结合（图4A）。Slc25a25的亚型在其外显子1序列中有所不同（图4A），其在N端编码不同数量的钙结合EF，这可能提供对特定亚型的不同钙敏感性。重要的是，在外显子1 RNA序列附近有一个PGC-1α特异性结合，该序列最接近完全依赖胰高血糖素刺激的第三个Slc25a25亚型（TV3）（图4A）。在五种Slc25a25亚型中，胰高血糖素的诱导特别促进TV3（图4B），与TV1和TV2（图4C）相比，PGC-1α的缺乏选择性地降低了该亚型的诱导，这转化为Slc25a25 mRNA和蛋白质量的减少（图4d-F）。这些结果表明，PGC-1α控制Slc25a25基因的表达，这种表达与远端内含子和近外显子1 RNA序列的特异性结合相一致。
图4. 胰高血糖素依赖的PGC-1α与Slc25a25远端内含子和近外显子1亚型特异性RNA序列结合增加mRNA和蛋白质表达。（A）Slc25a25基因产生5个mRNA转录本，具有三个不同的第一外显子（TV1到TV3）。与PGC-1α的特异结合峰靠近TV3的外显子1，用箭头表示。（B）Slc25a25的TV3是受胰高血糖素调控的主要变异体。（C和D）Ppargc1a的缺失特异性地抑制Slc25a25的TV3表达。（E）免疫印迹显示siPpargc1a对总PGC-1α和SLC25A25蛋白水平的影响。（F）分离线粒体后的免疫印迹显示，使用siPpargc1a后，线粒体中SLC25A25的蛋白水平降低。（G）使用特异性siRNA寡核苷酸消除SLC25A25的TV3对抑制胰高血糖素诱导的葡萄糖生成具有最强的效果。
5 SLC25A25调节ATP和GTP水平，并控制肝葡萄糖生成
SLC25A25是一种线粒体核苷酸转运体，已被证明能转运ATP。为了确定SLC25A25是否会影响原代肝细胞中的ATP水平，研究人员利用原代肝细胞在存在和不存在SLC25A25和胰高血糖素处理的情况下进行代谢产物谱分析。图5A-C显示，能量代谢产物如ATP和鸟苷二磷酸在SLC25A25耗尽后减少。此外，不同的糖酵解/糖异生代谢物，如1,6-磷酸果糖、二羟基丙酮磷酸和D-甘油醛-3-磷酸也减少（图5A）。某些TCA代谢物，包括异柠檬酸盐和苹果酸盐也受到SLC25A25缺乏的影响（图5B），这表明SLC25A25控制部分肝糖异生代谢物对胰高血糖素的反应。当SLC25A25耗尽时，ATP和三磷酸鸟苷（GTP）的减少（图5C）与肝葡萄糖生成减少一致（图3D）。有趣的是，与TV1相比，当TV3亚型被耗尽时，葡萄糖生成抑制的程度更高（图4G）。接下来研究人员评估这些ATP和GTP的变化是否与呼吸活动的改变相关。用Seahorse仪器测量原代肝细胞的耗氧率（OCR）（图5D）。胰高血糖素处理引起了OCR的增加；然而，SLC25A25基因敲除显著地减缓了这种增加，表明这种转运蛋白的活性对于胰高血糖素依赖性氧消耗的增加是必要的。这些结果表明，PGC-1α的RNA结合靶点SLC25A25控制着胰高血糖素的部分代谢活动，包括维持肝脏葡萄糖分泌所必需的能量增加。
图5. SLC25A25调节肝细胞中的ATP和GTP水平以及能量代谢。（A和B）使用siSlc25a25后原代肝细胞的代谢组学分析。图中显示了糖酵解/糖异生和TCA循环中间产物的相对水平。（C）siSlc25a25降低原代肝细胞ATP和GTP水平。（D）siSlc25a25和胰高血糖素刺激后原代肝细胞的耗氧率。
讨论
PGC-1家族作为转录共激活因子招募一系列蛋白质，对寒冷、运动和禁食等营养和环境压力作出反应。这个家族的所有成员都有一个N端转录激活域以及与转录因子结合的基序，例如，与激素核受体配体结合域结合的LXXLL基序。这些蛋白质激活基因表达的典型机制是通过招募基于转录因子的启动子和参与基础转录机制，包括PGC-1α在内的一些成员含有一个C端，其中SR和RRM域参与RNA结合，这表明除了启动子和转录因子招募外，还涉及其他机制。事实上，先前的研究已经通过与转录延伸因子的结合揭示了这些机制。虽然这些机制可能提供PGC-1α靶基因的调控，但是在特定的生物学反应中PGC-1α结合的RNA是未知的。研究人员报道了对肝细胞中胰高血糖素作用的PGC-1α结合RNA的转录组分析，这些结合区大部分为内含子序列，但也包括外显子区和5’ 剪接位点，暗示不同的调控机制。基于PGC-1α结合RNA的定位模式，很难归纳出PGC-1α与这些RNA结合的共同作用机制和特异性调控作用。此外，研究人员目前还不能确定RRM结构域是否是PGC-1α-RNA结合所必需的，或者更确切地说，这种结合是通过PGC-1α的其他结构域或与PGC-1α复合物相关的其他RNA结合蛋白介导的。因此，需要进一步深入研究PGC-1α与RNA结合的原理和其他特殊机制。然而，对于某些RNA序列，如Slc25a25中的第一外显子，PGC-1α结合可能会增加特定亚型的mRNA。这种调控带来了一个有趣的概念，基于位于基因转录起始的近端区域的RNA序列是否能够提供转录共激活因子的特异性来定义亚型特异性和mRNA转录表达水平。这样，RNA序列的存在可能像转录因子一样，作为特异性的激活剂来增加基因表达。这一机制与转录因子结合可进一步促进mRNA转录表达。事实上，胰高血糖素诱导基因Slc25a25可能就是这种情况，该基因编码不同的N端亚型，PGC-1α在具有特定代谢功能的亚型的外显子1序列附近精确结合。这些研究还表明PGC-1α通过不同的作用机制来控制基因，为调节代谢和能量反应提供了额外的观点。值得注意的是，PGC-1α结合RNA不是已知典型PGC-1α靶点的转录本，这些靶点包括编码与线粒体生物发生、OXPHOS、TCA循环、脂肪酸氧化或糖异生有关的蛋白质的核基因，但其中一些与胰高血糖素和空腹反应有关。
这些研究也暗示了胰高血糖素如何控制肝细胞的能量代谢。胰高血糖素诱导的PGC-1α与一系列已知的控制葡萄糖生成的RNA结合，表明这种激素利用PGC-1α作为RNA结合蛋白来增加特异性基因的表达。这种调控为胰高血糖素的动态、时间和空间调控提供了其他的机制。PGC-1α是CREB/TORC2和CBP/p300激活后第二阶段禁食控制的一部分，增强了禁食反应并提供了减弱的反馈机制。除了已知的转录靶点，包括HNF4α驱动的PEPCK和G6Pase，PGC-1α还使用其他调控糖异生反应的作用结合RNA，包括FOXO1、CAMK1δ、KLF15和SLC25A25。这些多个机制可能起到确保葡萄糖分泌增加的作用，这是空腹期间生存所必需的过程。有趣的是，PGC-1α结合到一种特殊的Slc25a25亚型，一种钙调节的线粒体转运体，控制其表达，在胰高血糖素作用期间提供代谢和能量调节。研究人员认为胰高血糖素是启动Slc25a25转录所必需的，PGC-1α通过结合特定转录本的RNA，为该转录本的表达提供选择性。在N端有不同EF钙结合位点的特异性SLC25A25的表达，可能定义了控制线粒体和胞浆间ATP转运的动力学。值得注意的是，这种转运蛋白是维持细胞内ATP和GTP水平所必需的，这表明它控制着能量机制。