逆行示踪技术Retrograde Tracing

逆行示踪技术（retrograde tracing）也称为逆行标记技术，是神经科学中的一种常用研究方法，1967年Fink等将神经纤维变性研究与银浸渍染色技术两者结合应用后开创了逆行示踪技术的首次尝试，并取得了开创性的结果，此后该技术经过学者们的不断改进与创新，已日渐成为神经科学中不可替代的重要研究方法。逆行示踪技术通过在神经元的周围轴突或运动终板处注射逆行示踪剂，利用神经元的主动转运或被动转运机制将注射部位的示踪剂转运至神经元胞质内，具体的途径包括：受体介导或浓度依赖的跨膜转运以及胞吞作用等，被神经元摄取的逆行示踪剂依靠轴浆运输的动力机制从注射部位的轴突远端逐渐运输至相连的神经元胞体及树突，一段时间后整个神经细胞内将充满示踪剂，此时可根据逆行示踪剂的种类选择不同的检测方法，从而观察被标记的神经元数目及形态等。该技术可用于神经系统中某些特定核团传入神经的起源追踪研究，从而进一步帮助人们推断这些核团的具体功能，为解开中枢神经系统及外周神经系统复杂的投射网络提供了一种可行的研究方法。

逆行示踪技术（retrograde tracing）是神经科学研究中的一种常用的示踪方法，其能够从定性及定量的角度探究神经系统之间的复杂问题，为那些关于中枢神经系统功能、细胞间相互联系、神经细胞分布及数目等方面的研究提供了一种简单有效的实验方法。随着逆行示踪技术的不断发展，其在神经科学研究中的作用也更加被学者们所认可，尤其是近30年来，由于示踪剂种类和应用方法日益革新，逆行示踪技术的发展可谓日新月异。目前研究中应用较多的逆行示踪剂有：霍乱毒素B亚单位、荧光金、辣根过氧化物酶、固蓝、异硫氰酸盐罗丹明、羰花青染料、荧光乳胶微球、生物胞素和神经生物胞素等；常用的应用方法有：压力注射法、电离子渗透导入法和染料晶体植入法。

常用逆行示踪剂：

霍乱毒素B亚单位abs80001（Cholera toxin subunit B ，CTB）CTB是目前应用非常广泛的一类逆行示踪剂，其来源于霍乱弧菌产生的霍乱毒素，作为霍乱毒素中的非毒性亚单位，CTB可以通过与神经节苷脂GM1的戊多糖链结合从而使毒素粘附于细胞表面，基于这一原理，使得CTB可以选择性地被那些富含神经节苷脂GM1的神经细胞所摄取，从而特异性地标记神经细胞，正是由于CTB在细胞中的摄取有赖于CTB与神经元突触膜上GM1神经节苷脂特异性的结合，此种跨膜转运的方式不会影响细胞的形态学变化，因此更适合于细胞形态学的研究。通常情况下，CTB在使用前常需配置成1%的CTB磷酸盐缓冲液。起初CTB是作为非荧光示踪剂而被应用于逆行示踪技术中，直到荧光结合形式的CTB出现后，其才逐渐转变为一种常用的荧光示踪剂，尤其是近几年Alexa Fluor (AF)与CTB的成功结合可以说是荧光示踪剂中的一重要突破，因为AF系列的荧光比以往的荧光更强、更稳定。目前AF荧光结合形式的CTB在探究视网膜功能和中枢神经系统复杂的关系方面应用的日渐广泛，同时不同种类AF荧光的应用也促使了多重逆行标记的发展。此外研究发现CTB具有良好的相容性，其可与其他示踪剂如葡聚糖胺等同时混合注射来进行逆行标记。

荧光金（Fluoro-Gold，FG）1986年Schmued等首次发现了FG这一新型染料，其通常以1-10%的浓度溶解在缓冲液中，逆行示踪时可以采用离子电渗导入法或者压力注射法将FG溶液注射到目标靶区。注射部位的FG可以通过受损的轴突和轴突末端，不断地在细胞膜形成的囊泡内积累，然后以逆行运输的方向向细胞胞体方向转运，一段时间后，可以在被标记的神经元胞体内观察到颗粒状的FG染料[3]。羟芪巴脒是FG中主要的有效成分，它的光学特性随酸碱值的大小而变化。在生理条件下，用325nm波长的合适激发光激发FG后可以产生最大波长为440nm的金黄色荧光，具有良好的灵敏度及稳定性。随着技术的发展，FG-抗体的出现意味着FG还可以转变为一种更稳定而不淬灭的形式被应用于逆行示踪技术中，这无疑扩大了FG的适用范围。值得注意的是，尽管FG在逆行标记中有很多明显的优势，但它并不适合于那些需要长时间等待后观察标记效果的逆行示踪研究。

辣根过氧化物酶abs47047679（horseradish peroxidase，HRP）HRP作为逆行示踪剂的应用无疑是一次突破性的进展，Kristensson和Olsson等于1971年第一次将酶蛋白（即HRP）注入到大鼠的腓肠肌内，并于一段时间后通过二氨基联苯胺（DAB）基质染色法检测脊髓运动神经元内的HRP的活性，从此开创了酶蛋白在逆行示踪技术中的探索应用。同年，该方法也被成功地用于标记大鼠舌下神经核内的运动神经元。研究发现HRP的内吞摄取过程不仅可以发生在神经元的所有突起部位，其同样可以发生在神经元的胞体部位，此外，在注射部位采取压力注射方法更容易使HRP被周围的神经元突起摄取，被神经元摄取进入细胞内的HRP会以核内体的形式被运输至神经细胞的核周体部位而被溶酶体代谢性降解，镜下典型的核内体往往呈现出椭圆形或管状的外观。目前，HRP在逆行示踪技术中的应用形式有很多种，如泡沫、凝胶和微球等，但采用颅内注射0.1-0.5μl浓度为20-50%的HRP盐溶液仍然是中枢神经系统研究中最经典的应用方法，因为无论是泡沫、凝胶和微球中的任一种HRP应用形式都很难进行注射，只能采用局部植入的方式进行逆行示踪。HRP的检测需依赖于自身的酶活性，其可与过氧化氢、DAB或者四甲基联苯胺（TMB）反应后生成稳定及高电子密度的棕色沉淀，正是这个原因，被HRP逆行标记的神经元可以在电镜下进行超微结构的分析，然而，HRP在逆行示踪技术中同样存在很多明显的缺陷，如无法完整显示被标记的细胞以及无法在活体下直接进行检测等。

固蓝（Fast Blue，FB）3%FB水溶液是常用的逆行示踪剂，其可被神经元的轴突末端摄取，并均匀分布在细胞胞体内，但其对树突的充盈并不理想。当用360nm波长的紫外光激发时FB可发出蓝色的荧光，但长时间照射可产生较高的光毒性，这也是大多数蓝色荧光示踪剂如True Blue（TB）和Granular Blue(GB)等的常见问题，相比于它们而言，FB在逆行标记中的效果更好。延长逆行标记动物的存活时间可以增加FB在神经元内的荧光强度，但这也容易导致荧光的渗漏，造成神经元周围胶质细胞的着色和被标记神经元细胞个数的减少。研究发现在细胞培养条件下，FB可影响细胞的粘附与增殖，这将限制其在细胞培养方面的应用。

异硫氰酸盐罗丹明 abs47047683（Rhodamine-isothiocyanate，RITC ）RITC作为逆行荧光示踪剂可被波长为545nm的绿光激发出波长大于590 nm的红色荧光，注射时其通常以1-3%的浓度溶解于含有0.2%乙醇或1%二甲基亚砜（DMSO）的水溶液内。研究表明RITC较FB而言，其在被标记的细胞内可以更长时间的存留而不发生荧光渗漏，效能上明显优于FB。在细胞培养条件下也未发现明显的光毒性。在逆行示踪研究中RITC的荧光强度比羰花青染料的更强，细胞内的分布更加均匀。绿色荧光的FITC可以与红色荧光的RITC二者联合应用从而实现双重标记，但是FITC的荧光淬灭速度比RITC更快，所以并不适合活体情况下的双重逆行标记。

羰花青染料（Carbocyanine dyes）羰花青染料具有高度的亲脂性，即便是对于被固定的组织，其仍然可以透过它们的细胞膜而进行标记，但是亲脂的特性也限制了其在活体研究中的应用。羰花青染料通常被溶解在有机溶剂中，常用的有机溶剂有乙醇/DMSO的等比混合液以及二甲基甲酰胺,注射浓度为2.5-3%。当羰花青染料以囊泡的形式被神经元摄取后，其将在细胞内各个方向进行主动扩散，但细胞间并不会发生染料的扩散。在稳定性方面，其可以在很长一段时间内保存良好的活性，研究发现其甚至可以在活体条件下保存稳定达1年以上。在多样性方面，羰花青染料有多种颜色的荧光可供选择，如红色荧光的Dil和绿色荧光的DiO等，它们的在逆行示踪研究上的有效性已经在很多研究上得以证实。

荧光乳胶微球（fluorescent latex beads）荧光乳胶微球内可包含红色和绿色两种荧光物质，其中由罗丹明红色荧光填充的微球在信号强度上优于绿色荧光填充的微球。其在逆行示踪注射之前需要提前配制成水溶液，局部应用时可用针头直径30-50μm的Hamilton注射器直接注射，应用的剂量根据靶区域的大小从30nl-0.5μl之间不等[38]。目前关于荧光乳胶微球的具体摄取机制还不是很清楚，局部注射后存活24-48时即可观察到被其逆行标记的大多数神经元，此外，这些被标记的神经元表现出良好的组织稳定性，即便是数月后也未曾观察到示踪剂的渗漏现象，正是这些优点使得荧光乳胶微球成为了神经解剖学中逆行标记神经元的一种可靠选择。但值得注意的是，由于乳胶微球通常只能显示出被逆行标记的胞体，相比于很多荧光染料而言并不具备优势，同时，其在丙三醇溶剂中荧光容易淬灭的特性以及暴露在二甲苯和酒精内容易遭受破坏的特点也限制了其更广泛的应用。

生物胞素和神经生物胞素（biocytin and neurobiotin）生物胞素和神经生物胞素最初是作为一种细胞内标志物而被用于电泳试验中，此后人们发现其还可以用于神经解剖学中的示踪研究。研究证实，生物胞素和神经生物胞素不仅可用于逆行示踪技术中，其同样可以应用于顺行示踪技术中，采用强电流和大孔径移液器的细胞外电离子渗透导入法是其常用的注射方式。由于生物胞素和神经生物胞素在细胞内具有良好的转运特性，因此可以清楚地显示被标记神经元的轴突和树突结构。与其他种类的示踪剂相比较，生物胞素和神经生物胞素的分子量相对较小（分别为372kDa和286kDa），同时具有高亲和力的抗生物胞素蛋白能与之特异性的结合，因此当用这些结合有HRP的抗生物胞素蛋白与标记细胞内的生物胞素和神经生物胞素特异性结合时，便可间接地依赖HRP对标记的细胞进行显影，这便是该示踪剂能被检测的原因。除了HRP可被结合于抗生物胞素蛋白外，研究还发现荧光染料同样也可被结合到抗生物胞素蛋白上，因此学者在研究中可以根据自己的需求选择不同的抗生物胞素蛋白，但值得注意的是，无论是那种方法，因为都需要借助免疫组织化学或免疫组织荧光进行显色，缺点就是过程繁琐及无法在活体上直接进行观察。

葡聚糖胺（Dextran amines）事实上，葡聚糖胺更多的情况下是被作为一种顺行示踪剂而应用于研究中，但其同样可以被用作逆行示踪剂而应用于研究中。在理化性质方面，葡聚糖胺具有很好的水溶性，其分子质量较FG、羰花青染料和RITC等大（10kDa）。研究发现，葡聚糖胺在注射部位更容易被损伤的神经元摄取并逆行转运至胞体内，因此当在局部注射葡聚糖胺进行逆行标记时，如果联合注射5%的Triton X-100将会在一定程度上提高神经元对葡聚糖胺的摄取效率。葡聚糖胺是神经解剖学中非常重要的一类示踪剂，其可以非常精细地显示被标记细胞的突起结构并能被多种检测方法检测，例如：葡聚糖胺可以与荧光染料或生物胞素形成复合物，从而能够根据复合物的特性而被相应的检测方法检测出来。然而，葡聚糖胺标记的细胞在保存时间上较FG等示踪剂短，因此其可能更适合于那些持续时间较短的实验研究。

3. 常用应用方法逆行示踪技术中除了需要选择合适的逆行示踪剂，如何将选择的示踪剂导入到目标部位也是需要考虑的重要环节，目前研究中应用最广泛的局部导入方法有三种：即压力注射法、电离子渗透导入法和染料晶体植入法。

压力注射法（Pressure injection）压力注射法是一种最简单直接的示踪剂导入方法，在注射之前只需要对示踪剂进行溶解，然后借助微量注射器（如Hamilton注射器）和标准的电控推拉器即可完成注射。根据电控推拉器的原理不同，压力注射时的动力可来源于气体压力或者液压装置系统，其中后者较前者在控制注射剂量的精确性方面更为准确，因此更加受到学者们青睐。

压力注射法在选择示踪剂的溶剂时需要考虑到示踪剂自身的溶解特性，如FB、FG和葡聚糖胺等水溶性的示踪剂需选择水性溶剂，而其他如羰花青染料等则需要选取有机溶剂进行溶解，此外，对于那些不溶性的染料在注射前需要对其配置而成的悬浊液进行超声粉碎，并用过滤器进行过滤后才可以直接应用压力注射法局部注射导入到目标靶区。至于每种逆行示踪剂的注射浓度，则需要充分考虑其自身的标记敏感性和局部的毒性反应等。

电离子渗透导入法（Iontophoretic injection）电离子渗透导入法是利用示踪剂分子所带电荷量的大小，通过给予外加电流使示踪剂分子被电场作用力导入至注射部位的一种示踪剂导入方法。通常情况下，人们会将电流直接外加到吸有1-10%浓度示踪剂溶液的微量移液器上，根据电极头直径的不同，电离子渗透导入法除了可以应用于示踪剂的细胞内注射外，还可以应用于示踪剂的细胞外注射。以具体的操作为例，在进行电离子渗透导入法细胞内注射时，逆行示踪剂通常被溶解在2M氯化钾溶液或2M乙酸钾溶液内，注射时外加电流的强度为2-5nA，并至少维持10-60分钟。研究发现，电流维持时间作为电离子渗透导入法中最主要的调控参数，其可随着应用低摩尔浓度的电极溶液而被极大程度的缩减，例如将生物胞素以电离子渗透导入法的方式完全地导入至神经元胞体内，在应用0.5M的乙酸钾溶液时只需用3nA的电流维持3分钟即可完成[61]。对于电离子渗透导入法的细胞外注射，其电极头的直径会相对更大，外加的电流也会增加至10μA，此外，电离子渗透导入法还具备一个独到的优势，其可以依靠传统的电生理技术对目标靶区进行精确的定位，从而使示踪剂的导入更为准确。

染料晶体植入法（Insertion of dye crystals）当逆行示踪的目标靶区位置表浅且容易暴露时，可以选择染料晶体植入法进行示踪剂的局部导入。其优点是可以在显微镜直视下进行操作，因此可以良好地控制染料晶体植入的部位和深度，此外，其在逆行示踪剂导入的有效性方面也较其他种类的方法更高。在局部应用羰花青染料（如Dil和DiAsp）作为逆行示踪剂时，染料晶体植入法是一种可供选择的有效方法，此外，对于那些以结晶形式存在的示踪剂在进行小剂量的逆行示踪时，同样可以选择该方法作为示踪剂的局部导入方法，如小麦胚芽凝集素共轭结合的辣根过氧化物酶（wheatgerm agglutinin conjugated to HRP，WGA-HRP）。有研究发现，对于亲脂性羰花青染料，如果在植入染料晶体之前对其表面滴加1滴弗氏不完全佐剂可以很好地提高示踪剂在组织内的扩散能力。此外，还有学者指出染料晶体植入法不仅仅适用于那些位置表浅且容易暴露的组织标记，其同样可以将植入深度增加至400μm以上，从而实现对深部脑组织的逆行标记。

目前应用的示踪剂大致可被分为荧光示踪剂和非荧光示踪剂两大类，其中荧光示踪剂因为自身具备发放荧光的特性，标记后可直接观察，操作简单易行，可应用于活体组织或细胞培养方面的研究，此外，其因为自身多荧光种类的多样性，可实现多种荧光示踪剂在同一个体内的同时标记，即多重示踪。

本文章引用来源： 姚飞 眼科学 新疆医科大学 2016（学位年度）