MPB：华中农大谢卡斌组-CRISPR靶向消除16S-seq中植物序列的方法
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Cas-16S-seq：利用CRISPR/Cas9靶向消除16S-seq中高丰度植物序列的方法
Cas-16S-seq: Using CRISPR/Cas9 to Eliminate Abundant Plant Sequences in 16S-seq
宋露洋，谢卡斌*
作物遗传改良国家重点实验室，作物病害监测和安全控制湖北省重点实验室，华中农业大学，武汉
*通讯作者邮箱: kabinxie@mail.hzau.edu.cn
摘要：16S rRNA基因高通量测序 (16S-seq) 是研究微生物组的常用方法之一。在分析植物或其他高等生物的样品时，线粒体和质体16S rRNA基因也被通用引物扩增，造成测序结果中宿主序列的污染最高达99%以上，不仅提高了成本，而且极大地限制了16S-seq方法分析植物微生物群落结构的灵敏度。Cas-16S-seq的方法是一种利用CRISPR/Cas9靶向切割植物16S rRNA基因序列从而富集扩增产物中细菌序列的方法 (图1) (Song和Xie，2020)。该方法操作简单，可以方便地整合到已有的16S-seq流程中，能高效率地消除共扩增的高丰度植物序列。我们的分析也表明Cas9具有高特异性，通过使用我们开发的生物信息学平台设计的植物特异的gRNA，未检测到脱靶切割细菌16S rRNA的现象。本文以水稻为例，描述了Cas-16S-seq的详细步骤和实验要点，为科研人员使用该方法分析植物微生物组提供参考。
关键词：16S rRNA基因高通量测序 (16S-seq)，CRISPR-Cas，宿主污染，微生物组，植物
材料和试剂
1.50 ml离心管 (Corning, catalog number: 430829)
2.RNase-free 0.2 ml PCR管 (Axygen, catalog number: PCR-02D-C)
3.RNase-free 1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
4.丁腈手套 (AMMEX, catalog number: APFNCHD50)
5.Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIP) (New England Biolabs, catalog number: M0290S)
6.Bsa I (New England Biolabs, catalog number: R0535S)
7.Cas9 (New England Biolabs, catalog number: M0386S)
8.DH5α (Vazym, catalog number: C502-03)
9.Protease K (New England Biolabs, catalog number: P8107S)
10.T4 DNA ligase (New England Biolabs, catalog number: M0202S)
11.T4 polynucleotide kinase (T4 PNK) (New England Biolabs, catalog number: M0201S)
12.pUC19-gRNA (Addgene plasmid #137776，质粒图谱见图1)
图1. pUC19-gRNA载体示意图
13.16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (TaKaRa, catalog number: RR176)
14.Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, catalog number: A63880)
15.DNeasy Powersoil Kit (QIAGEN, catalog number: 12888-50)
16.Gel Extraction Kit (OMEGA, catalog number: D2500-02)
17.HiScribe Quick T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs, catalog number: E2050)
18.I-5 2× High-Fidelity Master Mix (Molecular Cloning Laboratories, catalog number: I5HM-200)
19.QIAGEN plasmid mini kit (QIAGEN, catalog number: 12123)
20.RNA Clean & Concentrator Kit (Zymo Research, catalog number: R1017)
21.Double-distilled H2O (ddH2O)
22.KCl (Fisher Scientific, catalog number: P217-500)
23.KH2PO4 (Fisher Scientific, catalog number: P285-500)
24.LE Agarose (Hydragene, catalog number: R9012LE-100g)
25.NaCl (Fisher Scientific, catalog number: S271-1)
26.Na2HPO4 (Fisher Scientific, catalog number: S374-500)
27.TWEEN 20 (Fisher Scientific, catalog number: BP337-100)
28.75%乙醇，80%乙醇 (用95%乙醇和0.1‰ DEPC处理水配制)
29.75%医用酒精 (国药试剂)
30.氨苄青霉素 (国药试剂)
31.苯酚 (国药试剂)
32.焦碳酸二乙酯 (DEPC, Sigma, catalog number: D5758)
33.氯仿 (国药试剂)
34.无核酸酶水 (Zymo Research, catalog number: W1001-4)
35.无水乙醇或95%乙醇 (国药试剂，分析纯)
36.无水乙酸钠 (国药试剂，分析纯)
37.液氮
38.磷酸盐缓冲溶液 (见溶液配方)
39.0.1‰ DEPC处理水 (见溶液配方)
40.3 M 醋酸钠 (pH 5.2) (见溶液配方)
仪器设备
1.96孔磁铁架 (BORHEE, catalog number: MAG-96-11)
2.剪刀和镊子
3.研磨钵和研磨棒
4.移液器 (2.5，20，200，1,000 μl) (Labnet, catalog numbers: 540910296, 340930114, 240750135, 440960631)
5.NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, catalog number: ND-ONE-W)
6.DNA电泳装置
7.超净工作台
8.小型离心机 (Eppendorf, catalog number: 022620498)
9.台式离心机 (Cence, catalog number: TDZ5-WS)
10.涡旋振荡器 (Scientific Industries, catalog number: G560E)
11.水浴锅
12.37 °C恒温培养箱
13.PCR热循环仪 (Bio-Rad Laboratories, S1000TM Thermal Cycler, catalog number: 1852148)
14.研钵和研磨棒
15.-20 °C冰箱
16.pH计 (METTLER TOLEDO, catalog number: FE20K)
软件和数据库
1.VSEARCH软件 (version 2.8.1)
实验步骤
Cas-16S-seq是将CRISPR/Cas9系统与现有的16S rRNA基因高通量测序 (16S-seq)进行结合，利用CRISPR/Cas9靶向切割特定序列的能力，从而在16S rRNA基因扩增子文库构建过程中去除大量共扩增的宿主序列(图2) (Song和Xie，2020)。其中CRISPR是“成簇和规律间隔的短回文序列”的简称，而Cas是指与CRISPR RNA结合的蛋白。在不同的CRISPR-Cas系统中，化脓性链球菌Cas9 (Strepcococcus pyogenes Cas9)被广泛应用于基因组编辑中，而本文提到的Cas9均表示来自化脓性链球菌的Cas9。本文以799F-1193R扩增16S rRNA基因V5-V7片段为例，介绍了Cas-16S-seq中gRNA设计、体外合成、植物根系DNA纯化、Cas9处理和PCR扩增的详细步骤，该方法也适用于其他16S rRNA通用引物的扩增子测序分析。
图2. Cas-16S-seq实验流程示意图
一、gRNA设计
Cas9核酸酶可以在一个人造的小RNA分子 (称为gRNA, 即Guide RNA)的引导下去靶向切割DNA双链 (Jinek等，2012)。其中利用Cas9/gRNA标靶特定的DNA位点只需满足2个条件：(1) gRNA的5′端20nt (Nucleotides)的向导序列 (称为Spacer或Guide sequence) 与靶DNA位点的序列 (称为Protospacer) 互补匹配；(2) 靶位点必需存在PAM (Protospacer-adjacent motif)，其中使用最广的化脓链球菌Cas9的PAM序列为5′-NGG-3′。根据Cas9/gRNA靶向切割DNA双链的条件，因此可以通过替换gRNA 5′端20nt (Nucleotides)的向导序列，从而使Cas9能被重编程去切割任何的包含有5′-N20-NGG-3′ (N代表任何核苷酸) DNA序列，其中N20与gRNA向导序列相同的20个碱基，NGG是Cas9发挥活性必需的PAM。近年来对Cas9介导的基因组编辑的广泛研究，也阐明了CRISPR/Cas9的靶向规律 ( Hsu等，2013；Pattanayak等，2013；Kuscu等，2014)，Cas9/gRNA不仅能有效的剪切与gRNA完全匹配的DNA片段，而且也能脱靶到与gRNA部分匹配的DNA片段，因此Cas-16S-seq方法的关键步骤是设计能够区分宿主和细菌16S rRNA基因的高特异性gRNA。本文以水稻16S rRNA基因为例，简要地介绍了Cas-16S-seq所需gRNA的设计流程 (图3)。
图3. CRISPR/Cas9靶位点 (即gRNA设计) 分析流程图
1.从公共数据库下载高质量的原核生物16S rRNA基因序列。这些数据库包括RDP (Cole等，2014)，SILVA (Quast等，2013)，和GreenGenes (McDonald等，2012)等。本研究使用RDP数据库 (RDP release 11, update 5, https://rdp.cme.msu.edu/, release 11)的细菌16S rRNA序列作为参考。
2.从NCBI数据库中查找和下载水稻栽培品种Nipponbare参考基因组叶绿体和线粒体16S rRNA基因序列 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gen-ome/10)。
3.提取水稻线粒体和叶绿体16S rRNA基因序列中PAM (5′-NGG-3′) 前的所有的20 bp序列作为mt-gRNA (靶向线粒体序列) 和cp-gRNA (靶向叶绿体序列) 的向导序列。
4.从RDP数据库的3,356,809个原核16S rRNA基因序列中提取5′-NGG-3′和5′-NAG-3′ PAMs (Cas9也能低效率的识别和切割含NAG序列PAM的靶位点) 前的所有20 bp序列。
5.将步骤3和步骤4挑选出的20 bp序列利用VSEARCH软件 (version 2.8.1) 进行序列比对，此处使用的是全局比对算法。
6.根据图3的标准鉴定脱靶到RDP-rRNA中原核生物16S rRNA基因序列的cp-gRNA和mt-gRNA。计算每个gRNA脱靶到的RDP-rRNA中原核生物16S rRNA基因序列的数量，并根据脱靶的数量对gRNA特异性进行排序。
注：在分析cp-gRNAs特异性时，需要注意RDP数据库中含有叶绿体序列，可分析过程中可以把RDP中叶绿体序列排除在外。具体的设计靶向宿主16s rDNA特异性的gRNA的生物信息学代码流程存储在Github (https://github.com/KabinXie/Cas-16S-seq/tree/master/gRNA-design)。
二、gRNA的合成
使用含有T7启动子和gRNA scaffold序列的质粒载体 (如图2)，然后通过PCR获得仅含有T7启动子gRNA的DNA模板用来体外转录合成gRNAs，gRNA的克隆方法参考(Xie等，2014)。
1.引物设计和合成。根据图2所示，对每一个gRNA合成两条互补的引物：
Forward oligo (正向引物):
5′-TAGG-N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20-3′
Reverse oligo (反向引物):
5′-AAAC-N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20-3′
注：引物中TAGG和AAAC是和pUC19-gRNA匹配的接头序列，N代表任意碱基，正向引物中第3个G是T7聚合酶的转录起始位点。正向引物中20个N表示与靶位点相同的引导序列；反向引物中N表示与靶位点互补的碱基序列。
2.利用Bsa I对pUC19-gRNA载体进行酶切，反应体系如下。
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pUC19-gRNA |
2 μg |
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10× NEB Buffer 4 |
2 μl |
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10× BSA |
2 μl |
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Bsa I (10 U/μl) |
1 μl |
|
Add ddH2O to |
20 μl |
3.37 °C孵育2~4小时。
4.(可选步骤) 加入0.5 µl的CIP (5 U/μl) 对步骤1酶切的质粒进行去磷酸化，37 °C孵育30分钟。
5.利用QIAquick PCR purification kit纯化酶切的质粒载体，纯化操作按照说明书进行，最后一步加入30 μl Elution buffer溶剂进行DNA的洗脱。
6.利用NanoDrop测定DNA浓度。
7.对于每个gRNA，将合成的单链DNA寡核苷酸 (如步骤1所示) 退火为双链DNA寡核苷酸。
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Forward oligo (100 µM) |
1 µl |
|
Reverse oligo (100 µM) |
1 µl |
|
10× T4 DNA ligase Buffer |
1 µl |
|
T4 PNK (10 U/µl) |
0.5 µl |
|
Add ddH2O to |
10 µl |
注：如果步骤4没有使用CIP处理，T4 PNK在此处可以忽略，而且下一步中37 °C孵育步骤也可忽略。
8.使用以下程序在PCR热循环仪中孵育。
|
37 °C |
60 min |
|
95 °C |
10 min |
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Cool down to 25 °C at 0.1 °C/s |
约 12 min |
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25 °C |
5 min |
9.将退火形成的双链DNA寡核苷酸按照1:200的比例进行稀释。
10.将稀释的双链DNA寡核苷酸与载体进行连接反应，反应体系如下：
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Bsa I digested vector |
n µl (~50 ng) |
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Oligo-duplex (diluted) |
1 µl |
|
10× T4 DNA ligase Buffer |
0.5 µl |
|
T4 DNA ligase (400 U/µl) |
1 µl |
|
Add ddH2O to |
5 µl |
11.室温 (25 °C) 孵育2~4小时，或者4 °C连接过夜。
12.取1 µl连接产物加入到大肠杆菌DH5α细胞进行转化。
13.挑取2~4个单克隆在添加有氨苄青霉素 (50 µg/ml) 的LB培养基中进行培养。
14.使用QIAGEN plasmid mini kit提取质粒。
15.使用M13R (-48)引物进行Sanger测序，确认gRNA靶序列正确。
16.使用正向引物M13F (5’-GGTAACGCCAGGGTTTTCC-3’)和反向引物gRNA-R (5’-AAAAGCACCGACTCGG-3’)从构建的质粒载体上扩增带有T7启动子和靶序列的gRNA片段，扩增体系如下所示。
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Plasmid (步骤15测序正确) |
1 ng |
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I-5 2× High-Fidelity Master Mix |
25 μl |
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M13F (10 μM) |
2 μl |
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gRNA-R (10 μM) |
2 μl |
|
Add ddH2O to |
50 μl |
17.运行如下PCR程序：
98 °C预变性2分钟；扩增35个循环：98 °C变性10秒, 55 °C退火30秒，72 °C延伸10秒；循环完成后72 °C放置5分钟。
18.利用1.5%琼脂糖凝胶进行PCR产物凝胶纯化。利用OMEGA凝胶提取试剂盒回收正确大小(~190 bp)的DNA条带，操作步骤按试剂盒说明书进行，最后使用25 μl Elution buffer溶剂进行DNA的洗脱。
19.将凝胶回收产物用苯酚：氯仿进行抽提纯化，去除RNA酶 (以下步骤需使用RNase-free的试剂和耗材)。
19.1DNA溶液中加入等体积 (25 μl)的1:1苯酚：氯仿混合液，涡旋混合30秒；10,000 × g室温离心5 min，吸取上清到新离心管中。
19.2用等量的氯仿抽提两次去除残留的苯酚 (同步骤19.1)。
19.3加入1/10体积 (5 μl) 醋酸钠 (pH 5.2，3 M) (DEPC处理水配制) 和两倍体积的无水乙醇。-20 °C放置至少30分钟。
19.412,000 × g离心15分钟沉淀收集DNA，并去除上清液。
19.5加入500 µl的75%乙醇 (DEPC处理水配制)，12,000 × g离心15分钟，移去上清液。
19.6晾干并加入10~15 µl无核酸酶水溶解DNA。
19.7利用NanoDrop测定DNA浓度。
注：为防止经过切胶回收和苯酚氯仿抽抽提纯化后浓度可能会过低，建议步骤16同时配制2~3个PCR扩增体系 (总体积100 μl以上)，保证最终纯化后DNA浓度在10 ng/μl以上。
20.将苯酚:氯仿抽提纯化的DNA片段作为模板，利用HiScribe Quick T7 High Yield RNA Synthesis kit进行体外转录。在离心管中加入以下试剂：
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Nuclease-free H2O |
18-n µl |
|
NTP Buffer Mix |
10 µl (6.7 mM each NTP final) |
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Template DNA |
n µl (75 ng) |
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T7 RNA Polymerase Mix |
2 µl |
|
Total reaction volume |
30 µl |
注：本体外转录反应适合小RNA分子 (gRNA) 的体外转录，反应需使用无核酸酶的试剂和耗材，避免RNA核酸酶的污染。
21.37 °C孵育16个小时。
22.gRNA转录体系中加入20 µl无核酸酶水，吸打混匀后再加入1 µl DNase I (2 U/µl), 37 °C继续孵育15分钟，酶解DNA模板。
23.利用RNA Clean & Concentrator Kit进行纯化体外转录的gRNA。操作步骤按试剂盒说明书进行。最后一步加入15 µl无核酸酶水洗脱后，利用NanoDrop进行RNA的浓度测量 (浓度约为4,000 ng/µl)。
注：为了评估所合成gRNA的长度和完整性，可通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析转录产物。
三、植物根系样品的分离和基因组DNA纯化
1.水稻根系取样方法。戴上丁腈手套并利用75%医用酒精进行消毒，握住水稻嫩枝直接拔取种植在田间水稻全株根系，避免对根系组织造成损伤。利用75%医用酒精对剪刀和镊子进行消毒，剪取根系后利用镊子将根系置于含有25 ml TWEEN 20 (0.1%) 的磷酸盐缓冲溶液的50 ml无菌管中。每取一次样品时，需利用75%医用酒精对镊子和剪刀进行消毒，并利用无菌滤纸擦拭干净。将取得样品迅速置于冰上运回实验室，样品不得置于冰上超过24小时。运回实验室的根系样品应迅速置于-20 °C (最好置于-80 °C)，且样品不得反复冻融。
2.将冻存在-20 °C的根系样品取出之后置于4 °C解冻样品，在超净工作台进行根系的清洗。首先，将解冻的根系取出放置在装有25 ml无菌双蒸水的50 ml无菌离心管中，漂洗去除表面附着的土壤颗粒，然后利用75%医用酒精消毒的镊子将根系取出后置于装有25 ml 含有TWEEN 20 (0.1%) 的磷酸盐缓冲溶液的50 ml无菌的离心管中，置于涡旋仪上涡旋30秒，重复涡旋清洗水稻根系3次以上，直到根系表面无清晰可见的土壤颗粒，台式离心机离心 (1,000 × g，15分钟)，用75%医用酒精消毒的镊子取出根系，最后在无菌的滤纸上将水稻根系擦干。将根系样品装入空的50 ml无菌的离心管中，置于-20 °C保存至DNA提取。
3.在提取水稻根系样品DNA之前，需要用液氮冷冻处理，然后再在研磨钵中充分研磨均匀。
注：研磨钵和研磨棒以及液氮是主要污染来源，需要经过多次双蒸水清洗以及高温高压灭菌处理 (或酒精灼烧)，防止细菌或残留植物组织污染，同时在整个取样，根系清洗以及研磨的过程中均要设置空白对照组，监测试验过程中是否带入细菌污染。
4.按照DNeasy Powersoil Kit的使用说明进行DNA的提取。DNA的浓度使用NanoDrop进行测量。
注：如样品量少，在最后一步加入30 µl的C6溶液进行DNA的洗脱。
四、16S rRNA一轮扩增
Cas-16S-seq文库构建采用两步PCR法。
1.第一步PCR，利用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit扩增16S rRNA的V5-V6-V7区，本研究使用含接头序列的通用引物为Rd1+799F和Rd2+1193R，引物的全长序列见下表。
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Primer Name |
Sequence (5’>3’) |
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Rd1+799F |
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG AACMGGATTAGATACCCKG |
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Rd2+1193R |
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG CGTCATCCMCACCTTCCTC |
注：下划线标注的分别为Read1测序引物序列 (Rd1) 和Read2测序引物序列 (Rd2)，其中合成的引物需ULTRAPAGE方法进行纯化，需用16S-free的水稀释引物。
2.按照下表准备扩增体系 (此步需要在超净工作台中进行)：
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Template DNA |
50~100 ng |
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PCR Premix |
12.5 μl |
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Forward Primer (Rd1+799F) (10 μM) |
0.25 μl |
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Reverse Primer (Rd2+1193R) (10 μM) |
0.25 μl |
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Add 16S-free H2O to |
25 μl |
注：使用灭菌处理的RNase-free枪头和PCR管，阴性对照使用16S-free的水为模板。
3.运行以下降落式PCR程序：
94 °C变性3分钟；扩增34个循环：94 °C变性1分钟，退火1分钟，72 °C延伸45秒；循环完成后72 °C放置10分钟。退火的温度被设定为60 °C进行4个循环，58 °C进行6个循环，56 °C进行8个循环，54 °C进行8个循环，52 °C进行8个循环。
4.取5 μl的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。其中共扩增的水稻线粒体PCR产物条带大小比细菌大约84 bp，阴性对照无条带 (图4)。
图4. 16S rRNA第一轮PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果.
#1-#3代表生物学重复，H2O表示16S-free水为模板的对照，*代表的是水稻线粒体Rd1+799F-Rd2+1193R扩增条带。
5.利用AMPure XP磁珠纯化PCR产物 (此步骤需使用RNase-free的试剂和耗材)
5.1将纯化磁珠从4 °C取出放置在室温 (~25 °C)，约30分钟使其恢复到室温，并在涡旋仪上进行充分混匀30秒。
5.2加入0.8倍PCR产物体积的Ampure XP磁珠于PCR产物中，利用移液器轻柔的混匀 (远离磁铁架)，室温孵育15分钟。
5.3将其放置在磁铁架上5分钟。
5.4小心移除上清液，不要吸取到磁珠。
5.5向PCR管中加入200 μl新配的80%乙醇 (DEPC水配制)，并且保持其在磁铁架上，室温孵育30秒，利用移液器小心移除上清液。重复此操作一次，并将残留的乙醇完全移除。
5.6晾干两分钟，此过程一直保持PCR管放置在磁铁架上。
5.7将PCR管从磁铁架上取下，加入20 μl的无核酸酶水，然后利用移液器上下轻柔吸打重悬磁珠，并在室温孵育5分钟。
5.8将PCR管重新放回到磁铁架上放置约2分钟，直到上清液无可见磁珠。
5.9将洗脱液18 µl取出放置到新PCR管中。
6.利用NanoDrop测定纯化后的DNA浓度。
五、利用Cas9和gRNA体外酶切 (此步骤需使用RNase-free的试剂和耗材)
为了消除共扩增的高丰度植物序列，利用Cas9/gRNA剪切第一轮扩增纯化产物中的共扩增的线粒体16S rRNA基因序列。
1.将“gRNA的合成”步骤体外转录合成的gRNA利用无核酸酶水稀释至60 (ng/μl)，然后90 °C热变性5分钟迅速置于冰上冷却。
2.在RNase-free 1.5 ml离心管中准备酶切体系：
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Nuclease-free H2O |
22 μl |
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NEBuffer 3.1 |
3 μl |
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1 µM Cas9 (M0386S) |
2 μl (60nM final) |
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gRNA (denatured) |
1 μl (60 ng) |
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Total reaction volume |
28 μl |
注：为了获得最佳的剪切效率，要将Cas9和gRNA以及剪切底物DNA的摩尔比保持在10:10:1或更高比例。分子量可通过 (http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation)进行换算。如果所用通用引物能扩增线粒体和叶绿体16S rRNA基因，该反应中需两种不同的gRNA (cp-gRNA和mt-gRNA)来去除宿主序列。
3.将准备的酶切体系室温 (25 °C)静置10分钟，然后加入磁珠纯化的一轮PCR产物2 μl (60 ng)，轻弹离心管混匀。
4.37 °C孵育12个小时。
5.将1 µl (0.8 U/μl) 的蛋白酶K加入到酶切反应中，并继续在37 °C孵育10分钟，然后65 °C水浴锅中孵育10分钟将蛋白酶K进行变性处理。
6.如“gRNA的合成”步骤20所述方法利用苯酚/氯仿抽提纯化酶切产物，最后加入10 μl无菌双蒸水溶解DNA，利用NanoDrop测定DNA浓度。
六、16S rRNA二轮扩增
为了加入Illumina平台兼容的测序接头序列，以及区分不同样品的index序列。利用酶切纯化产物为模板进行二轮扩增，PCR体系为25 μl，全长的引物序列见下表。
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Primer Name |
Sequence (5’>3’) |
|
P5-index-Rd-F |
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXTCGTCGGCAGCGTCAG |
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P7-index-Rd-R |
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTCTCGTGGGCTCGGAG |
注：下划线标注的为Illumina测序仪P5/P7端流动槽结合区，xxxxxx代表是index序列，其中合成的引物需ULTRAPAGE方法进行纯化。
1.设置如下PCR反应体系：
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Cas9 digested DNA |
10 ng |
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I-5 2× High-Fidelity Master Mix |
12.5 μl |
|
P5-index-Rd-F (10 μM) |
1.25 μl |
|
P7-index- Rd-R (10 μM) |
1.25 μl |
|
Add ddH2O to |
25 μl |
2.运行如下PCR程序：
98 °C预变性1分钟；扩增8个循环：98 °C变性30秒, 58 °C退火10秒，72 °C延伸15秒；循环完成后72 °C放置5分钟。
3.取5 µl的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，检测扩增产物 (图5)。
图5. 16S rRNA二轮扩增示意图.
靶向水稻线粒体16S rRNA基因的gRNA序列 (mt-gRNA1196)。Cas-16S-seq建库方法 (Cas9+)和常规16S-seq建库方法 (Cas9-)，#1-#3代表的是三个生物学重复，*代表水稻线粒体799F-1193R的扩增子序列。
4.二轮扩增产物利用上述“16S rRNA一轮扩增”步骤5磁珠纯化方法进行纯化。
5.利用NanoDrop进行DNA浓度的测量。
6.将纯化的产物按照等摩尔比进行混样，将混合文库再次利用1.8倍的磁珠进行纯化，然后样品在Illumina HiSeq 2500使用2 × 250 bp进行双端测序。
注：在整个实验过程中应始终设置包含试剂耗材，引物的阴性对照组。
溶液配方
1.磷酸盐缓冲溶液 (1,000 ml)
利用800 ml双蒸水溶解8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，利用HCl将pH调整到7.4，最后用双蒸水使体积定容到999 ml，高温高压灭菌，待恢复到室温后，加入1 ml的TWEEN 20并混合均匀后使用。
2.0.1‰ DEPC处理水
将DEPC按照1:10,000 (体积比) 加入双蒸水，放置于磁力搅拌器上搅拌超过8小时后高温高压灭菌处理。
3.3 M醋酸钠，pH 5.2 (100 ml)
将24.61 g的无水乙酸钠溶解于80 ml未灭菌的DEPC处理水中，加入HCl将pH调整到5.2，最后加入未灭菌的DEPC处理水定容至100 ml，高温高压灭菌。
致谢
本研究由国家自然科学基金 (31622047) 和转基因新品种培育重大专项 (2018ZX08010-05B)资助完成。
参考文献
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