科研 | Gut Microbes：人类微生物组的宏基因组分析揭示了肠道胆盐水解酶的丰度与宿主健康之间的关联
编译：逍遥君，编辑：小菌菌、江舜尧。
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肠道微生物组的胆汁酸代谢对宿主健康同时发挥有益和有害的作用。启动胆汁酸代谢的微生物胆盐水解酶（BSHs）对宿主生理表现出积极和消极的影响。本研究收集了5790个BSH同源物，并基于序列相似性网络将其分为7个簇。分析了380个健康参与者宏基因组中BSH的丰度和分布，观察到不同的簇在人类微生物组中占据了不同的生态位，含有信号肽的簇在肠道中相对丰富。然后，通过比较患者（n=1605）和健康对照组（n=1540）BSH基因的丰度，分析了BSH簇与12种人类疾病的相关性。该分析确定了BSH基因丰度与10种人类疾病（包括胃肠道疾病、肥胖、2型糖尿病、肝脏疾病、心血管疾病和神经系统疾病）之间显著相关。通过炎症性肠病和结直肠癌人群进一步验证了相关性。结合宏基因组数据，这些酶序列的大规模研究提供了肠道BSHs和人类疾病之间相关性的可重复评估。这些信息有助于未来BSH活性细菌对于改善人类健康的诊断和治疗应用。
论文ID
原名：Metagenomic analysis of the human microbiome reveals the association between the abundance of gut bile salt hydrolases and host health
译名：人类微生物组的宏基因组分析揭示了肠道胆盐水解酶的丰度与宿主健康之间的关联
期刊：Gut Microbes
IF：7.74
发表时间：2020.04
通讯作者：贾保磊&Dongbin Park
作者单位：齐鲁理工大学&中安大学
论文框架
从先前发表的文献（发表截止日期：2019年1月）中收集了在人体中具有代表性功能的实验表征酶的完整氨基酸序列。将这些蛋白作为种子序列进行组合，并使用BLASTP在UniProt数据库中检索假定的BSH，使用Cytoscape进行可视化。基于Clustal Omega比对，用MEGA X生成系统发育树。通过SignalP 5.0预测蛋白的信号肽。ShortBRED用于测定人类宏基因组中BSHs的丰度。以85%的氨基酸相似性阈值过滤簇中的BSHs，以识别非冗余的代表性序列。UniRef90被用作全面、非冗余的蛋白质参考目录。使用ShortBRED-Identify将这些代表性BSH序列与UniRef90进行比较，以识别BSH簇的代表性肽标记物。在获得区分肽标记物后，用默认参数进行ShortBRED-Quantify，根据来自HMP的380个宏基因组数据集定量标记丰度，然后将这些映射到SSN簇。根据ShortBRED-Quantify计算的每千碱基百万读段数值的相对丰度被转换成之前报道的“每个微生物基因组的拷贝数”。从NCBI的SRA下载2012年至2019年6月在Illumina平台上生成的人类肠道微生物组的宏基因组全基因组测序数据集。排除了包含模糊属性样本记录的数据集。在疾病的基础上，将数据分为个体患者样本和相应的健康对照，检测BSH基因与各疾病的相关性。为了均质化不同的数据集，使用Sickle软件以30 bp的质量阈值和50 bp的最小长度筛除低质量读取。使用默认设置的Burrows-Wheeler比对算法将高质量的测序读段与每个BSH簇的核苷酸序列匹配。使用BEDtools将肠道宏基因组样本中BSH基因的读取计数标准化为每百万宏基因组读取的读取计数，并使用R编程语言中的ggplot2软件包构建箱形图进行可视化。
主要内容
1 根据酶序列相似性网络，BSHs被分为7个簇
本研究从以前发表的论文中经实验表征的BSHs中共选择了44种酶（补充表S1）。在UniProt蛋白数据库中检索这些酶所属的蛋白，共获得5790个BSH同源物（补充数据集S1）。进一步使用酶功能启动-酶相似性工具（Enzyme Function Initiative-EnzymeSimilarity Tool，EFI-EST）构建具有这些序列的序列相似性网络（sequencesimilarity network，SSN），并在SSN上绘制实验表征的BSHs。最初以10-14（序列同源性>30%）作为e值的阈值构建SSN。结果表明，这些酶可分为4个簇；而属于簇1的酶可进一步分为4个亚簇（补充图S1）。当SSN的e值阈值提高到10-60（序列同源性>40%）时，5790个BSH同源物被解析为7个不同的簇。在e值为10-60的SSN中，每个簇含有至少一种已被生化表征的酶（图1）。进一步将e值增加到10-75（>50%序列同源性），蛋白被分类为大于20个簇。因为许多簇不包含任何实验表征的BSH（补充图S1），选择了e值为10-60的SSN进行进一步分析，分析表明同源性>40%的同源蛋白的生化或功能可能更加相似。从每个簇中选择了一个蛋白序列，这些序列的比对显示N末端的催化半胱氨酸高度保守（补充图S2）。系统发育分析表明，来自同一簇的蛋白质总是聚集在一起，在系统发育树中具有高水平的置信度（>85%），这进一步支持了BSHs的分类（补充图S3）。而且，簇间的低置信值（<40%）表明来自不同簇的酶的进化关系并不是特别显著。
在门水平上对SSN进行分类学分类分析，以探索这些序列的起源。簇1含有2342个BSH同源物，主要来自变形菌门（50.52%）和拟杆菌门（18.46%）。簇1中存在的古细菌BSHs仅占簇中总BSHs的2.44%。在簇2（1961个蛋白序列）中，蛋白主要来自厚壁菌门（73.12%）和放线菌门（18.46%）。簇3中的BSHs（813个蛋白序列）也主要来自变形菌门（53.67%）和拟杆菌门（24.32%），与簇1相似。簇4中的BSHs（175个蛋白序列）主要来自厚壁菌门（79.52%）和螺旋菌门（9.64%）。在其他簇（簇5-7）中，大多数BSHs来自厚壁菌门。进一步对每个簇中的蛋白是否包含信号肽进行了描述，信号肽是靶向蛋白进入或穿过膜的N末端分选序列（补充图S4）。结果表明，簇1中75%的蛋白质和簇3中89%的蛋白质含有信号肽，而其他簇中的蛋白质不含信号肽。基于系统发育和信号肽分析，BSH分类表明每个簇中的酶很可能具有直接的共同祖先，以及相似的生理功能。
图1 胆盐水解酶（BSHs）的蛋白序列相似性网络（SSN）。列在补充表格S1中的蛋白质依据UniProt数据库进行BLAST和查询。查询和BLAST结果（共5790个蛋白）采用阈值为10-60（序列同源性>40%）的e值生成网络。该网络显示了2396个节点，以90%的序列同一性过滤，共包含5790个蛋白质。根据节点编号对每个簇按照顺序进行排序和标记。每个簇的蛋白序列量显示在簇名称后的括号中。补充表S1中列出的每个簇的代表性节点被放大。来自同一门的节点用相同的颜色表示。簇的每个门的相对蛋白百分比列在底部。
2 使用SSN和ShortBRED估计BSHs在健康人微生物组中的分布和丰度
宏基因组样本取自健康受试者的6个不同部位：粪便、颊粘膜、龈上菌斑、舌背、前鼻孔（面部皮肤）和阴道穹窿。使用ShortBRED分析了从380个高质量宏基因组中的7个BSH簇的丰度（补充数据集S2）。其中粪便的微生物组用于代表下消化道的微生物组；颊粘膜、龈上菌斑和舌背的数据反映了口腔微生物组；身体部位包括有氧（面部皮肤）、微有氧（口腔和阴道）和无氧（胃肠道）环境。使用ShortBRED-Identify从每个簇中识别出BSHs的独特蛋白质序列标记（85%氨基酸同源性），然后使用ShortBRED-Quantify测量每个标记物在基因组读数中的丰度。通过对SSN中的序列标记物进行分类，对每个宏基因组样本内每个BSH簇的丰度进行定量。最后，使用先前估计的平均微生物基因组大小对差异丰度值进行标准化。
ShortBRED与SSN揭示了健康参与者人体微生物组中每个BSH簇的分布和丰度（图2a）。在人类微生物组中检测到SSN中所有7个簇的BSH基因序列；然而，簇的丰度和分布存在较大差异。簇1的酶在粪便样本中丰度最高（中位值=0.25）（图2b）。簇3酶是粪便样本中丰度第二高的酶（中位值=0.16）。簇2的中位值为0.10；而属于该簇的酶在阴道后壁含量最多（中位值=0.09）。簇4酶在所有身体部位的样本中表现出相对较低的丰度，但在面部皮肤和口腔的样本中均表现出较高的丰度。来自其他簇（簇5-7）的酶在人类微生物组中表现出相当低的丰度和较少的分布（补充图S5）。BSHs丰度的不同揭示了来自不同簇的酶的生态背景，也表明来自每个簇的酶可能与宿主生理和健康有不同的关联。
图2 来自健康受试者的380个微生物组中胆盐水解酶（BSHs）的丰度和分布。（a）基于ShortBRED测量的6个身体部位的7个BSH簇丰度和分布的热图。（b）6个身体部位簇1-4丰度的箱形图。Tukey箱形图显示了中位数、第一四分位数（Q1）和第三四分位数（Q3）。
3 宏基因组数据集的比较分析确定了肠道BSHs与人类疾病之间的关系
簇1-4是BSHs在健康人肠道宏基因组中丰度较高且广泛分布的，表明这些簇可能与某些疾病状态有关。为了探索微生物组和疾病之间的关联，在多个宏基因组病例对照研究中对这些基因进行了比较分析；从NCBI数据库得到健康人群肠道微生物宏基因组数据。这些数据均采用Illumina平台进行测序。总共检索到20项包括12种疾病的宏基因组研究。这些疾病包括胃肠道疾病{溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）、克罗恩病（Crohn’s disease，CD）、结直肠腺瘤（Colorectaladenomas，CA）和结直肠癌症（Colorectal cancer，CRC）}、肥胖、2型糖尿病（Type 2 diabetes，T2D）、肝脏疾病{轻度非酒精性脂肪性肝病（Mild nonalcoholicfatty liver disease，NAFLD）、晚期NAFLD和肝硬化}、心血管疾病（Cardiovasculardiseases，CVD）、神经系统疾病（帕金森病和癫痫）和乳腺癌（Breastcancer，BR）（补充表S2）。本研究共分析上述疾病患者样本1605例，健康对照（Healthy control，CTRLs）样本1540例。从UniProt数据库中检索簇1-4的基因的DNA序列。通过将基因映射到肠道宏基因组数据集来定量簇1-4中基因的丰度，如果特别标注，均使用Wilcoxon秩和检验计算显著性值（图3和补充图 S6）。簇5-7的BSHs丰度在健康人中较低（图2）。将基因进一步定位到与疾病相关的宏基因组队列表明，来自这些簇的基因在人类肠道中以低丰度存在（补充图S7）。因此，未考虑对这些簇进行进一步分析。
BA影响胃肠道的事实促使我们检查炎症性疾病（UC和CD）、CA和CRC中BSHs的丰度（图3）。结果显示，BSH的富集与炎症性肠病（Inflammatory boweldiseases，IBD）显著相关（图3）。对来自欧洲（丹麦和西班牙）和美国的两个群体的分析表明，CD（患者190名，健康人174名，簇1和簇3的p值分别为2.2e-16和0.003）和UC（患者148名，健康人174名，簇1和簇3的p值分别为0.004和0.034）。相反，来自簇2（无信号肽）的酶在CD患者肠道中的丰度显著降低（p=2.2e-16）。CA的数据（患者117名，健康人52名）收集自5个国家（奥地利、加拿大、法国、德国和美国）的3项独立研究。簇1和簇3中基因的丰度与疾病呈负相关（p值分别为3.6e-10和2.5e-8）。在CRC患者和健康人之间观察到簇2的BSHs丰度的相似关系（患者254名，健康人285名，p=2.7e-05），其中CRC的数据来自奥地利、中国、加拿大、意大利、德国、法国和美国的6个独立群体。综上所述，BSH基因丰度与各种胃肠道疾病显著相关，包括CD、UC、CA和CRC；然而，BSH簇之间的正相关或负相关关系各不相同。
高脂肪、低纤维的“西方”饮食极易诱发肥胖、糖尿病等代谢性疾病。肥胖是T2D的主要风险因素，占所有糖尿病病例的90-95%。肥胖或T2D患者的胆汁酸浓度较健康人高，因而调节胆汁酸水平和信号传导已被公认为是治疗这些疾病的一种强效治疗方法。在本研究中比较了患者和对照组肠道中BSHs的丰度。结果显示，来自丹麦的肥胖队列中簇3酶的丰度显著增加（患者169名，健康人123名，p=0.021）。同样，与中国队列相比，T2D患者肠道中簇1酶的丰度增加（患者187名，健康人183名，p=0.028）。有趣的是，这两个簇都含有具有N末端信号肽的酶。此外，这两个簇的酶水平升高与患者总胆汁酸水平升高一致。
胆汁酸在肝脏中合成。此外，在肠道中产生的次级胆汁酸；它们可通过肝门静脉转运至肝脏，并可影响肝脏健康。使用来自美国的NAFLD群体和来自中国的LC群体进一步测量了肝病患者肠道微生物组中的BSH基因丰度（图3）。对于轻度NAFLD（患者72名，健康人308名），簇1-4的酶丰度与疾病显著相关（p值分别为1.4e-06、5.0e-08、1.0e-10和0.0004）。簇2和簇3的BSHs丰度也与晚期NAFLD有关（患者14名，健康人308名，p=1.3e-07和0.043）。在簇1、2、3和4的BSH基因中，LC患者和CTRL之间也观察到负相关（患者123名，健康人114名，p值分别为0.008、1.2e-06、1.0e-16和0.048）。在这些显著的关系中，BSH基因的丰度总是降低的。总体而言，肠道中大多数BSH基因簇的丰度与NAFLD和LC呈负相关。
据报道，肠道微生物组的改变也与远隔器官的其他疾病有关，如CVD、神经系统疾病和BR。我们能够定量相关疾病受试者肠道微生物组中不同BSH簇的丰度（图3）。基于对中国宏基因组数据集的分析，所有4个BSH簇均与CVD相关（患者171名，健康人214名，p值分别为7.4e-04、0.0011、8.8e-07和6.9-e04）。未携带信号肽的簇2和簇4的BSHs丰度显著增加；含有信号肽的簇1和簇3的BSHs丰度显著降低。我们还测量了来自德国的帕金森病宏基因组队列（患者31名，健康人28名）中BSH基因的丰度。结果显示，BSH基因的丰度与该病无关（p>0.05，Wilcoxon检验或t检验）。然而，根据对德国数据集的分析（患者24名，健康人22名，p=0.002和2.3e-15），簇1和簇2的BSH基因丰度与癫痫显著相关。改变的肠道宏基因组与BR相关；然而，我们通过分析来自中国的宏基因组队列（患者62名，健康人71名，p>0.05，Wilcoxon检验或t检验）发现BSH基因丰度在健康参与者和乳腺癌患者之间没有显著差异。这些分析证明，肠道微生物组中BSHs的丰度也与距肠道较远的器官中的疾病有关。
图3 胆盐水解酶（BSHs）丰度与宿主疾病关联的气泡图。气泡大小设定为3个水平，对应于统计学显著性（0.01<p<0.05，0.001<p<0.01，和p<0.001）通过Wilcoxon秩和检验或两样本Student’st检验确定，用于比较健康对照组和患者的宏基因组。广义折叠变化显示为热图。红色气泡用于指示疾病条件下BSH基因丰度的增加，而蓝色气泡用于指示BSH基因丰度的减少。这些疾病的缩略语如下：CD：克罗恩病，UC：溃疡性结肠炎，CA：结直肠腺瘤，CRC：结直肠癌，T2D：2型糖尿病，m-NAFLD：轻度非酒精性脂肪性肝病，a-NAFLD：晚期 NAFLD，LC：肝硬化，CVD：心血管疾病，PD：帕金森病，BC：乳腺癌。
4 在独立研究人群中验证BSH丰度与疾病之间的相关性
为了验证BSH基因在肠道和人类疾病中的相关性，我们使用另外两个独立的宏基因组人群与CD（患者13名，健康人236名）、UC（患者69名，健康人236名）和CRC（患者91名，健康人61名）进行了独立的验证（图4）。从丹麦和西班牙的一项独立研究中检索UC和CD人群，而从法国和德国的另一项独立研究中检索CRC人群。与此前方法相同。CD人群的验证显示，簇1、2和3的BSHs与疾病状态显著相关（分别为p=0.0042、0.024和0.046）。UC人群的验证表明，簇1-4均与疾病疾病相关（分别为p=0.031、0.0074、0.035和0.0001）。最后，在法国和德国的人群中，只有簇2的BSHs与CRC显著相关（p=3.8e-07）。这些结果表明，验证人群中BSH的丰度在显著性方面与检测人群中BSH的变化高度一致。总之，这些结果建立了BSHs与人类疾病之间的关系。
图4 使用独立研究人群验证肠道中胆盐水解酶（BSHs）丰度与疾病状况之间的相关性。比较健康对照组（C）和疾病病例组试验和验证人群中BSH基因的丰度特征。这些疾病的缩略语为：CD：克罗恩病，UC：溃疡性结肠炎，CRC：结直肠癌。采用双样本Wilcoxon秩和检验确定显著性。
讨论
破译一个具有多样功能的蛋白质家族的功能、分类和进化是一项具有挑战性的课题。系统发育树和树状图常被用来描述蛋白质家族之间的序列关系；然而，由于这种方法计算量大，并且需要准确的序列比对，因而很难处理大规模的数据。相反，基于更多序列的蛋白质SSN可以建立一个全局视图来解释序列、结构及功能。尽管SSN方法是使用BLAST的bit-score来区分序列同源性，这与系统发育分析中的序列比对不同，但之前的研究仍表明，SSN可作为揭示序列-结构-功能关联和蛋白质家族之间进化关系的有用的可视化工具。本研究收集了以往研究中实验表征的酶，并进一步将量扩展到5790个蛋白序列。SSN将酶分为7个簇，如系统发育树所示（图1）。分类系统使得每簇具有各自独特的特征。首先，不同簇蛋白间的序列同源性均<40%。再者，系统进化树显示7个聚类间无明确的进化关系。这一分析提示，7个簇可能是由不同的水解酶前体进化而来，可能在整个进化史上多次出现，这与之前关于BSH进化的研究一致。其次，分类系统将有和无信号肽的酶分开：簇1和簇3中的大部分酶具有N端信号肽，而其他簇中的酶缺乏这些肽。第三，分类系统将酶从不同的门中分离出来（图1）。簇1和簇3中的酶主要来自变形菌门和拟杆菌门，而其他簇中的酶主要来自厚壁菌门。第四，分类将细菌的不同生态位与BSHs联系起来。编码簇1、簇2和簇3中BSHs的细菌在人类肠道中大量存在，而编码簇4中BSHs的细菌在口腔中大量存在。此外，编码簇2中BSHs的细菌在阴道中大量存在。总之，这些分析表明，基于大规模SSN的BSHs分类为BSH酶家族的进化、功能和生态学提供了新的见解。
此前对甘氨酰自由基酶和转运蛋白的SSN研究表明，SSN每个簇中的蛋白具有相似的生化活性；然而，这一结论似乎不适用于BSH簇。例如，尽管该簇中的两种酶（UniProt ID：R6GBZ3和A0A380KNN4）与GCA相比仅具有60%的同一性，但比活度却有8倍的差异；另一方面，来自簇2（R6GBZ3）和簇7（E2YQS1）的酶即使只有20%的同源性，却显示出与GCA相似的比活度。根据蛋白序列或系统进化树分析无法区分BSH与青霉素V酰胺酶的底物特异性，表明两者关系密切。仍需要对BSHs的生物化学和结构进行额外的研究，以阐明酶的多样性和底物特异性。
SSN与ShortBRED一起显示了BSHs在人类微生物组中的丰度和分布，这为包含不同BSHs簇的细菌生态位提供了新的见解（图2）。簇2中的BSHs主要存在于阴道中，表明簇2中含有BSHs的细菌可以在阴道中定植。同样，簇4中的BSHs在龈上菌斑中含量很高，暗示这些BSHs可能与牙齿健康有关。这些数据为精确操纵BSH活性细菌以便改善人类健康提供了重要线索。例如，簇2中含有BSHs的细菌，在阴道中表现出良好的定植，可能作为改善阴道健康的有前景的益生菌。这些数据也帮助我们对BSHs进一步研究的优先级进行了排序。在44种实验表征的酶中，34种酶属于簇2，只有5种酶（簇1中2种，簇3中3种）含有信号肽（增补表S1）。然而，ShortBRED结果显示，属于簇1和簇3的酶在肠道中比簇2中的酶更丰富，这表明BSH研究的重点应该从簇2切换到簇1和簇3。
胆汁酸代谢与许多人类疾病相关。本研究结果表明，BSH基因丰度与IBD、CA和CRC相关（图3）。在本研究中，在CD条件下观察到的簇2的BSH基因丰度降低与之前的研究一致。IBD中簇1和簇3的BSH基因的丰度增强。这与两个公认的IBD相关分类特征一致：（1）厚壁菌门的门水平降低和（2）变形菌门的门水平增加，因为簇2中的BSHs主要来自厚壁菌门，而簇1和簇3中的BSHs主要来自变形菌门。此外，对来自7个国家的6项独立研究的分析表明，主要是厚壁菌门的簇2的BSH基因的丰度与CRC相关，这与之前的研究一致，表明厚壁菌门在CRC患者的肠道微生物组中被耗尽。综上所述，这些分析表明BSHs的丰度与胃肠道疾病高度相关。
高脂饮食可增加肠道中胆汁酸的水平。摄入高脂膳食后中肠胆汁酸浓度可达1 mM。与各自的瘦型对照受试者相比，高脂饮食诱导肥胖的小鼠模型或肥胖人类的肠道中厚壁菌门的丰度增加，拟杆菌门的丰度降低。常规饲养的小鼠高水平表达重组BSH导致胆汁酸、血浆胆固醇、肝甘油三酯和宿主体重显著降低，因而BSH可能是调节宿主脂质代谢和体重增加的重要靶点。本研究的分析表明，来自厚壁菌门（簇2和簇4）的BSHs丰度与肥胖和T2D无关。相反，来自簇1和簇3的BSHs（含有N末端信号肽，主要来自变形菌门和拟杆菌门）在T2D和肥胖患者中显著增加，表明来自变形菌门或拟杆菌门的BSHs可能对宿主健康有巨大贡献。该结果与先前研究一致，先前研究表明含多形拟杆菌信号肽的BSH可改变体内胆汁酸含量，并对宿主代谢状态产生显著影响。考虑到具有BSH活性的益生菌可作为预防和治疗肥胖的可能方法，因而提出具有属于拟杆菌门而不是厚壁菌门的BSH活性的细菌可以成为改善肥胖的潜在益生菌。
脂肪肝与肥胖和T2D密切相关，可能发展为非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化，并最终发展为肝癌。NAFLD患者总粪便胆汁酸浓度较高；相反，肝硬化与总粪便胆汁酸浓度降低有关。本研究分析显示，大多数BSH簇在肝病患者中的丰度低于对照受试者。在短肠综合征相关肝病仔猪模型中也观察到具有BSH活性的细菌减少，其受法尼醇X受体（Farnesoid Xreceptor，FXR）信号改变的调节。Zhan等人报道称，FXR在塑造小鼠肠道菌群中发挥重要作用，用FXR拮抗剂治疗可以同时降低编码BSHs的细菌丰度和BSH活性。有趣的是，FXR的表达在肝脏疾病的发展过程中下调。在此背景的基础上，我们提出肝病患者BSH丰度的降低与宿主FXR表达水平有关；但还需要进一步的实验来阐明相关的潜在机制。
BSH基因丰度也与远隔器官的疾病有关，如CVD和癫痫（图3）。BSH活性益生菌已被证明具有降低胆固醇的功效，高胆固醇与CVD密切相关，这意味着这些细菌可能具有改善心血管功能的巨大潜力。此外，BSH活性产生的胆汁酸可通过在心血管组织中表达的G蛋白偶联受体（TGR5和毒蕈碱受体）和核受体（FXR和孕烷X受体）调节心血管功能。特别是，有和无信号肽的酶簇均与CVD呈负相关。这些分析表明，不同簇中的BSHs可能与CVD有不同的相关性。同样，胆汁酸可以和膜结合受体或核受体结合，在大脑信号传导中也发挥重要作用。因此，胆汁酸的作用也可见于神经系统疾病。然而，BSHs调控神经系统疾病的潜在机制仍知之甚少。
个体之间在肠道微生物组的组成方面存在高度变异性，这可以通过饮食、早期微生物暴露、遗传背景和其他因素来解释。在这项研究中，对BSHs进行了大规模分析，以克服这些混杂因素。通过定量大量健康参与者中酶的丰度和分布，使用大规模队列研究确定了酶簇与人类疾病之间的相关性。我们检索了20个宏基因组数据集，均在Illumina GenomeAnalyzer II至IlluminaHiSeq 4000的Illumina平台上进行测序。然而，包括样本采集、储存、DNA提取和测序在内的每个方法学步骤都可能影响整体最终结果，这个问题可以通过分析多个宏基因组病例对照研究来解决。在本研究中，我们使用了一个以上的数据集来量化BSHs和胃肠道疾病之间的关系，包括CD、UC、CA和CRC，因为这些疾病中的微生物组已经在多项研究中得到了很好的表征和研究。只使用一个数据集来检测微生物组和其他疾病之间的关系；然而，使用UC、CD和CRC独立群体的验证研究表明，通过此方法确定的关系具有高度重现性。最后，我们建议研究中使用的流水线高度有效和可靠。未来，应该纳入更多的宏基因组数据集，增加对全宏基因组测序的了解，这可以提供更准确和明确的关于微生物基因丰度和人类疾病之间关系的细节。
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