前沿综述丨Kisspeptin对下丘脑垂体-卵巢轴的调控作用
摘要
Kisspeptin 是调节女性生殖功能重要的神经肽，主要在下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）神经元的上游起作用，与GnRH神经元上的相应受体GPR54结合后刺激GnRH的释放，从而导致生殖轴后续一系列的活动。然而，近年来研究显示，Kisspeptin不仅在中枢下丘脑和垂体调控女性生殖功能，而且在卵巢局部也发挥作用。卵巢局部的Kisspeptin不仅参与调控卵母细胞、颗粒细胞、黄体的功能，同时又受促性腺激素、光周期、交感神经、代谢的影响。本文就Kisspeptin的中枢调控以及卵巢局部作用进行综述。
女性生殖功能主要由下丘脑-垂体-卵巢轴（HPOA）调控。简而言之，下丘脑分泌的促性腺激素释放激素（GnRH）作用于垂体，促使垂体分泌促黄体生成激素（LH）和卵泡刺激素（FSH），LH与FSH则刺激卵巢分泌性激素（雌激素、孕激素等），而性激素亦可通过正反馈或负反馈作用于下丘脑或垂体并调节相应激素的分泌。Kisspeptin是调节女性生殖功能重要的神经肽，在下丘脑、垂体和卵巢中均有表达，对HPOA各个环节均有调节作用［1］。
Kisspeptin是黑色素瘤细胞抑制基因KiSS-1的产物［2］，是Kotani等［3］于2001年从人胎盘中分离出对孤儿G蛋白偶联受体GPR54表现出激动活性的天然肽。KiSS-1基因编码Kisspeptin，首先产生的是含145个氨基酸的前体-Kisspeptin，随后水解成Kisspeptin-54、Kisspeptin-14、Kisspeptin-13和Kisspeptin-10等小分子肽。这些小分子肽拥有相同的C端，可与相应的受体GPR-54（也称KISS1R）结合并激活该受体［3］。GPR54是G蛋白偶联受体，其编码基因位于人19p13.3［4］。KiSS-1与其受体GPR54一起组成KiSS-1/GPR54系统，参与下丘脑-垂体-性腺轴（HPG）功能的调节，并在青春期启动和促性腺激素释放过程中发挥非常重要的作用［5］。在很多生殖领域疾病中都发现了KiSS-1水平的异常，如在多囊卵巢综合征患者的血清中发现较高的Kisspeptin水平，并与血清游离睾酮水平相关［6］。因此，了解Kisspeptin对HPOA的调节作用有可能提供生殖疾病的新的治疗靶点。
过去10年，学者们主要集中在对Kisspeptin的中枢调控方面的研究。然而，近几年则发现，Kisspeptin不仅存在于中枢下丘脑，而且也存在于垂体［7］和卵巢中［8］，表明Kisspeptin既有中枢调控作用，又有外周调节作用。本文综述了Kisspeptin的中枢调控作用和外周调节作用
一.下丘脑Kisspeptin的中枢调控作用
1. Kisspeptin在下丘脑中的分布及表达情况
在啮齿类动物，下丘脑内Kisspeptin神经元位于下丘脑的弓状核（arcuate nucleus， ARC）和前腹侧室周核（anteroventral periventricular nucleus， AVPV）。位于ARC的Kisspeptin神经元除了表达Kisspeptin外，还共表达神经激肽B （neurokinin B， NKB）和强啡肽（dynorphin，Dyn）两种神经肽，因此也被称作Kisspeptin/神经激肽B/强啡肽（Kisspeptin/NKB/Dyn， KNDy）神经元。位于AVPV的Kisspeptin神经元和位于ARC的KNDy神经元共同调控GnRH的分泌，从而发挥对生殖轴的调节作用。
2.下丘脑Kisspeptin的生理功能
下丘脑内GnRH神经元以脉冲的形式分泌GnRH，通过不同的脉冲频率和幅度来调控垂体LH和FSH的分泌。低频率的GnRH脉冲优先刺激FSH的分泌，而高频率的GnRH脉冲优先刺激LH的分泌［9］。Kisspeptin主要在GnRH神经元的上游起作用，将性激素的反馈作用和代谢信号传递给生殖轴［10］。GnRH脉冲的频率和幅度由Kisspeptin神经元和KNDy神经元控制，Kisspeptin增加GnRH脉冲的幅度，KNDy神经元上的dynorphin则降低GnRH脉冲的频率。
3.下丘脑Kisspeptin的调控机制
（1）下丘脑Kisspeptin与性激素：Kisspeptin神经元接受卵巢分泌的性激素的正负反馈，研究显示AVPV的Kisspeptin神经元主要接受雌激素的正反馈，ARC的Kisspeptin神经元则接受雌激素的负反馈［11］。在卵泡起始阶段，雌激素水平低下，此时，雌激素的负反馈信号传递给ARC的KNDy神经元，KNDy神经元被激活，则Kisspeptin、NKB、Dyn分泌增加，而此时Dyn引起低频率的GnRH脉冲，导致FSH分泌增加，刺激卵泡的募集和生长。随着卵泡的生长，雌激素的分泌逐渐增加，KNDy神经元活性下调，GnRH脉冲频率增加，导致LH分泌开始增加，而FSH的分泌逐渐减少。当到排卵前阶段时，AVPV的Kisspeptin神经元接受雌激素的正反馈信号，产生高幅度的GnRH脉冲，同时接受负反馈信号的ARC中KNDy神经元分泌的Dyn减少则引起高频率的GnRH脉冲，如此高频率和高幅度的GnRH脉冲引起排卵前LH的激增，从而引发排卵［9］。
（2）下丘脑Kisspeptin与环境信号：为何LH的激增能如此精确地控制在排卵前呢？此时就突显出了下丘脑的视交叉上核（SCN）的作用。SCN调节体内各种昼夜节律活动。研究显示，源于SCN的精氨酸加压素（AVP）投射到AVPV核的Kisspeptin神经元并激活该神经元，继而导致GnRH神经元的激活［12］。源于SCN的血管活性肠肽（VIP）既可以直接刺激和调节GnRH神经元活性，又可以通过抑制背/腹内侧下丘脑（DMH）的RF酰胺相关肽（RFRP）神经元间接调节GnRH神经元活性。GnRH释放的增加激活了LH的合成和释放，而LH又进一步促进卵泡成熟、雌二醇合成，最后由LH的激增触发排卵［13］。
（3）下丘脑Kisspeptin与营养代谢信号：下丘脑神经肽Kisspeptin调节GnRH神经元释放GnRH来控制生殖轴，充足的能量储备是生殖轴发挥作用的关键。因此，营养代谢因子对Kisspeptin的合成和释放有着非常严格的控制。腹腔注射Kisspeptin-10的小鼠表现出明显的低进食量和进食频率，并伴有较高的血浆胰岛素、瘦素、抵抗素和高密度脂蛋白水平［14］。Kiss1r基因敲除的小鼠表现出明显的肥胖和能量消耗减少［15］。这些证据表明Kisspeptin调节机体的能量代谢。研究发现营养代谢信号可通过下丘脑弓状核区的Kisspeptin神经元上存在的营养代谢分子受体（如瘦素受体、胰岛素受体）直接影响Kisspeptin神经元，同时代谢信号也可通过其他神经元［如神经肽Y（NPY）/刺鼠色蛋白相关蛋白（AgRP）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、前阿黑皮素（POMC）/可卡因-苯丙胺调节转录肽（CART）神经元］间接影响Kisspeptin神经元功能［2］。
二.垂体Kisspeptin的调控作用
1. Kisspeptin在垂体中的分布及表达情况：除了下丘脑外，在一些物种的垂体中也检测到Kiss1的表达［7,16-17］。Yayoi等［7］研究了垂体Kisspeptin表达的个体发育变化，发现Kiss1 mRNA在胚胎和出生后垂体中均有表达，胚胎时期主要在垂体前叶的腹侧的促性腺激素和短暂促甲状腺激素前体细胞表达，出生后在垂体前叶的腹侧和背尾侧的促性腺激素/促甲状腺细胞系细胞中表达。
2. Kisspeptin在垂体水平上的作用：以往的研究表明，Kisspeptin对促性腺激素释放的作用主要是通过下丘脑GnRH介导的［16］。但垂体也表达Kisspeptin和GPR-54，说明Kisspeptin可以在垂体水平直接调节生殖功能。一项体外实验发现Kisspeptin-10可促进大鼠垂体细胞分泌LH的能力，这对Kisspeptin直接作用于垂体提供了明确的证据［17］。Suzuki等［18］在牛和猪的垂体也有相似的发现，Kisspeptin-10在1000 nmol/L和10 000 nmol/L浓度下均能显著刺激牛垂体前叶细胞分泌LH，100 nmol/L和1000 nmol/L的Kisspeptin-10对猪垂体前叶细胞分泌LH有显著的促进作用。
Witham等［19］研究显示Kisspeptin还可直接促进促性腺激素基因的表达，他们利用促性腺激素细胞LβT2和小鼠原代垂体细胞，对Kiss1和Kiss1r信号在促性腺激素基因β亚单位促黄体生成素β（luteinizing hormone beta， LHβ）和卵泡刺激素β（follicle-stimulating hormone beta， FSHβ）转录调控中的作用进行了分子分析，发现Kisspeptin诱导LHβ和FSHβ的表达，该作用是通过蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）、早期生长反应因子1和cFos介导的［19］。另外，Tselmeg等［20］采用高表达Kiss1R/ADCYAP1R的LβT2细胞研究了Kisspeptin对垂体促性腺激素的直接作用，结果显示，Kisspeptin不仅可以直接增加促性腺激素亚单位（Cga、Lhb和Fshb）的表达，还可以增强促性腺激素细胞产生促性腺激素的能力。这些结果提示Kisspeptin通过影响垂体基因表达来调节生殖功能。
3.垂体Kisspeptin的调控机制：研究表明小鼠垂体Kiss1 mRNA表达水平在性别间和产后早期差异无统计学意义，但在青春期开始时雌性的Kiss1 mRNA水平升高，在青春期后显著高于雄性，表明垂体Kiss1的表达可能与卵巢分化有关，并可能受到卵巢性激素的影响［7］。另外去势大鼠垂体中Kisspeptin表达下降，而用雌激素处理后，这一情况得以逆转［21］。Witham等［22］的研究也有相似的结果，雌二醇处理雌性小鼠诱导LH激增，垂体Kiss1r的表达明显增强。这些结果表明垂体Kisspeptin表达受到卵巢性激素的影响。
此外，Ikeda等［7］报道，在小鼠胚胎第13.5日到成年期间都能在垂体前叶观察到Kisspeptin免疫反应性，很多Kisspeptin阳性细胞与促性腺激素标志物（Foxl2、SF-1和LHβ）双重标记，并且Kisspeptin阳性细胞中LHβ阳性细胞的百分比随着发育而增加。这表明在发育过程中，垂体Kisspeptin表达不受性腺功能调节，但可能与成年期的促性腺激素功能有关。
三.卵巢Kisspeptin的调节作用
1.卵巢Kisspeptin的分布及表达情况：近十年里，研究者们相继在人、大鼠、小鼠、仓鼠、犬、狨猴、鸡、猪、牛的卵巢中检测到Kisspeptin的表达［8］，并且在卵泡的颗粒细胞、卵泡膜细胞、卵母细胞、卵泡液和黄体中均发现了Kiss/Kiss1r的免疫反应性。Kisspeptin在卵巢的分布受卵巢周期的影响，卵泡阶段的Kisspeptin表达明显高于黄体阶段［23］，而在生长卵泡和排卵前卵泡的膜细胞中Kisspeptin高表达，邻近排卵时，Kisspeptin开始出现在排卵前卵泡的颗粒细胞中［24］。Kisspeptin在卵巢卵泡、黄体的分布表明其在卵巢局部可能发挥作用。不仅如此，Tanyapanyachon等［23］在猫的卵巢里发现卵巢表面上皮也存在Kisspeptin/Kiss1r免疫反应性，说明Kisspeptin/Kiss1r在排卵后的修复过程中也有一定的卵巢重塑作用。
2. 卵巢Kisspeptin的生理功能：Liu等［24］就Kisspeptin对牛颗粒细胞的增殖和凋亡进行了研究。首先，他们的研究证明了牛颗粒细胞表达Kisspeptin。并且通过调节caspase-3、Bcl-2、Fas和FasL的表达而促进颗粒细胞的凋亡。但是，Basini等［25］研究显示Kisspeptin-10对猪颗粒细胞的活力和增殖没有影响。出现差异的原因，可能与物种的差异有关，Liu等［24］用的是牛颗粒细胞，而Basini等［25］用的是猪颗粒细胞。用Kisspeptin处理猪的颗粒细胞后，雌激素水平明显降低，而分泌的孕激素水平却显著升高，表明Kisspeptin可以促进颗粒细胞孕激素的分泌而抑制其雌激素的产生。
体外实验表明Kisspeptin-54可促进卵母细胞的成熟［26］，其作用机制可能是颗粒细胞和卵母细胞的双向交流作用［27］。
此外，研究表明Kisspeptin对黄体也有一定的作用。p234处理的卵巢、黄体和周围组织的边界变形［28］。表明Kisspeptin参与排卵后黄体化过程的组织重塑。Peng等［29］用Kisspeptin和人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin， hCG）处理了大鼠的黄体细胞，结果显示Kisspeptin对大鼠黄体细胞的雌激素分泌没有影响，但是却可以促进大鼠黄体细胞的孕激素分泌。
总而言之，Kisspeptin对雌激素分泌的影响尚不确定，可以是抑制的，也可以是没有影响的，还需更多的实验证明。但无论是黄体还是颗粒细胞，Kisspeptin对孕激素的分泌都表现出明确的促进作用。
3.卵巢Kisspeptin的调控机制
（1）卵巢Kisspeptin与促性腺激素：卵巢Kisspeptin水平受到LH的调节，用hCG模仿排卵前LH的激增，发现卵巢Kisspeptin mRNA显著增加，LH激增后是颗粒细胞和卵母细胞的双向交流作用（图1）来促进卵母细胞的成熟［27］。颗粒细胞表达LH受体［30］，排卵前，LH激增，LH与颗粒细胞上的LH受体结合刺激颗粒细胞大量合成并分泌Kisspeptin［28］，同时，颗粒细胞合成的具有促进卵母细胞发育的脑源性神经因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）也相应增加［31］。颗粒细胞分泌的Kisspeptin和BDNF分别与卵母细胞上相应的受体Kiss1r和截短NTRK2（truncated NTRK2，NTKR2.T1）结合并激活卵母细胞上的全长催化活性NTRK2受体（full-length catalytically active NTRK2 receptors，NTKR2.FL），从而启动PI3K-AKT介导的存活途径［27］，上调C-MOS、生长分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF9）和骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15，BMP15）表达［8］，维持卵母细胞的活力并排卵。
（2）卵巢Kisspeptin与光周期：在短光周期条件下，小鼠青春期推迟，伴随着下丘脑Kiss1神经元的数量减少［32］，说明中枢Kisspeptin受到光周期的调节。同样地，卵巢Kisspeptin也受到光周期的影响，而褪黑素在其中发挥重要作用。受到短光照的仓鼠卵巢Kiss1/Kiss1r表达明显降低［33］。仓鼠血清褪黑素浓度和给予光周期条件一致：短光照条件下，褪黑素分泌增加；当给仓鼠注入褪黑素后，卵巢Kiss1/Kiss1r表达明显降低［33］。动情前期和动情期时的仓鼠，Kiss1/Kiss1r表达增加，并且受到长光照刺激后，Kiss1/Kiss1r表达短暂增加提示可能参与排卵和/或恢复卵巢功能［34］。
（3）卵巢Kisspeptin与交感神经：Fernandois等［35］的研究显示，阻断β-肾上腺素能受体或切断卵巢神经节后，卵巢Kisspeptin表达下降证明交感神经系统参与调控卵巢Kisspeptin表达。在老化过程中，交感神经-卵巢Kisspeptin系统有重要作用（图2）。研究表明，亚生育期大鼠的卵巢Kiss1表达与年龄呈正相关，随着年龄的增加，卵巢Kiss1的表达也相应增加［36］。Merhi等［37］的研究也证实了卵巢Kisspeptin的表达与年龄有关。他们发现与生殖年龄组的小鼠相比，老年组小鼠的卵巢Kiss1和Kiss1r的mRNA水平明显增高。这些研究都证明了卵巢Kisspeptin的表达与年龄相关。此时，就突显出了交感神经-卵巢Kisspeptin系统在年龄老化机制中的作用。
在老化过程中，卵泡的储备功能下降，次级卵泡和窦卵泡进行性减少［35］。之所以出现这样的现象，是由于卵泡对FSH的敏感性降低所致。此时，交感神经-卵巢Kisspeptin系统在其中发挥了重要作用。Fernandois等［35］报道阻断β-肾上腺素能受体或切断卵巢神经节后，卵巢Kisspeptin表达下降、FSH受体（follicle-stimulating hormone receptor， FSHR）表达增加。以上研究表明交感神经-卵巢Kisspeptin系统通过下调FSHR表达来调控老化过程中卵泡分布的变化。另一方面，Kisspeptin还可促进抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）的表达［35］，增加的AMH抑制原始卵泡活化，从而导致卵泡募集减少。综上所述，在卵巢衰老过程中，交感神经-卵巢Kisspeptin系统从两方面来调控卵巢卵泡的分布：①下调FSHR，降低卵泡对FSH的敏感性下降，从而抑制卵泡发育；②上调AMH，抑制原始卵泡活化，使卵泡募集减少。
（4）卵巢Kisspeptin与营养代谢：肥胖明显损害女性生殖健康。高脂饮食的大鼠，体质量明显增加，动情周期紊乱，青春期提前，排卵相关的基因GDF9、FSHR、HPRT1和PTGS2下调［38］。而高脂饮食诱导雌性大鼠的生殖紊乱与卵巢Kisspeptin表达的变化有关［38］。与正常饮食组相比，高脂饮食的大鼠卵巢Kiss1 mRNA水平明显降低，并且窦性卵泡和排卵前卵泡的卵泡膜细胞的Kisspeptin免疫性明显降低［38］。而Zaher等［37］的研究不仅表明小鼠卵巢Kisspeptin的表达与体质量无关，还证实了人颗粒细胞中KISS1R的mRNA表达也与体质量指数无关。以上研究结果的不一致可能是由于实验方法、检测方法的不同而引起的。关于卵巢Kisspeptin是否受到肥胖的影响，还需更多的研究来证实。
多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome， PCOS）是一种常见的内分泌紊乱和代谢紊乱疾病，其特点是慢性无排卵、卵巢多囊化和高雄激素血症，不仅影响患者的生理健康［40］，同时对患者的心理也有诸多伤害［41］，更是影响子代生长发育以及代谢、神经精神、生殖等系统的发育［42］。然而，PCOS的发病机制尚不清楚，众多的研究围绕在胰岛素抵抗、高雄激素血症、HPG紊乱等方面［43］。普遍认为HPG的紊乱在PCOS的发生中起关键作用。而Kisspeptin作为调节HPG轴的关键分子，在PCOS发生发展中也有一定的作用。Kaya等［44］的研究显示PCOS不孕组患者的血Kisspeptin浓度较不明原因不孕组和男性因素相关不孕组明显升高。Tang等［45］总结了过去十年里有关PCOS患者血浆或血清Kisspeptin水平的研究，表明PCOS患者的Kisspeptin水平明显高于对照组。一项荟萃分析显示PCOS患者的血Kisspeptin水平不仅明显高于对照组，而且与血AMH浓度、血睾酮浓度以及血脱氢表雄甾酮（dehydroepiandrosterone， DDA）浓度呈正相关［46］。
中枢性性早熟（central precocious puberty， CPP）特点是青春期开始异常早，主要表现在8岁以下女孩和9岁以下男孩的第二性征的早期发育［47］。GnRH从下丘脑提前大量分泌并释放使青春期提前启动是CPP发生的关键机制。而Kisspeptin是调控下丘脑GnRH分泌的重要上游分子，因此Kisspeptin在CPP的发生中也有重要作用。葛伟等［48］对比了特发性中枢性性早熟（idiopathic central precocious puberty，ICPP）女童和正常健康女童的血浆Kisspeptin水平，发现ICPP女童的血浆Kisspeptin明显高于对照组。另外，在CPP患者中发现了KISS1R和KISS1基因的激活突变，但这样的病例很少，表明KISS1R和KISS1基因的激活突变是CPP非常罕见的分子机制［49］。
卵巢早衰是指40岁以下女性卵巢中的卵泡迅速减少，没有或很少卵泡的疾病，影响1%的育龄妇女。Kiss1r单倍体不足的小鼠表现出卵巢早衰的特征，包括排卵率的过早下降、窦性卵泡的逐渐丧失、卵母细胞的丢失以及所有类型的窦前卵泡的减少，并且伴随生育率的降低［50］。这些发现提示Kisspeptin信号通路可能参与了卵巢早衰的发病机制。
下丘脑闭经（hypothalamic amenorrhea，HA）是一种功能性疾病，其特征是GnRH分泌减少，GnRH/LH分泌的脉冲模式消失，主要表现为基础循环LH水平降低和LH搏动频率/振幅降低［51］。下丘脑神经肽Kisspeptin是最近发现的GnRH脉冲发生器，对GnRH/LH搏动有积极的调节作用。因此，Kisspeptin是HA患者恢复生殖轴功能的潜在治疗方法。对HA患者皮下注射Kisspeptin-54（6.4 nmol/kg），第1日HA患者血清LH和FSH水平显著提高，但这些反应在注射后第14日显著降低［52］，表明长时间应用Kisspeptin-54会导致促性腺激素脱敏反应。Channa 等［51］的研究显示，对HA患者持续静脉滴注Kisspeptin-54（1.00 nmol·kg-1·h-1）后，血清LH显著升高，5 h达到峰值；此后，血清LH水平逐渐下降，至10 h输注结束时，与峰值水平相比降低了50%，进一步确定了Kisspeptin-54治疗增加HA患者基础和脉冲性LH分泌的剂量范围。总之，Kisspeptin在HPOA的各个环节都发挥作用。但是在调节女性生殖功能方面，目前研究还是认为下丘脑Kisspeptin在其中起着主要作用，同时垂体Kisspeptin和卵巢Kisspeptin也可能发挥一定辅助作用，但是具体作用机制还有待进一步深入研究。
作者：杨立1 王青2 王志3 董浩旭3 程玲4 黄冬梅1
本文刊登于《中华生殖与避孕杂志》2021, 41(2): 177-183.