先导阅读丨JMC：FBDD药物发现技术盘点
成都先导技术团队编辑丨
FBDD（Fragment-based drug design）是一种将随机筛选和基于结构药物设计有机结合的药物发现新方法。自1981年提出以来，随着片段设计，筛选和优化技术的不断提高，FBDD逐渐从理论走向实际，成为当今主流的药物发现技术之一。迄今，全球共有4款由FBDD技术衍生的药物获得FDA批准，超过40种化合物处于临床阶段中。
FBDD相较于传统的高通量筛选（HTS）有着独特的优势，因此受到工业界和学术界的广泛关注。美国化学会自2015年以来，每年都会对公开发表的成功的fragment-to-lead案例进行总结和评估，以跟踪和讨论FBDD技术的新兴趋势和未来发展方向。近日，Wolfgang Jahnke等人在Journal of Medicinal Chemistry上发表了该系列中题为《Fragment-to-Lead Medicinal Chemistry Publications in 2019》的第五期文章（以下简称“文章”），盘点了2019年公开发表的FBDD药物开发情况。
图1：Journal of Medicinal Chemistry期刊盘点
2019年公开发表的FBDD药物开发情况
文章首先对2019年的案例进行收集和研究，再根据筛选规则进行甄别，最终严格挑选出符合入选标准的20个案例，并以此为基础进行了以下几个方面的探讨。
图2：2019年符合入选标准的20个FBDD案例
（图片参考：参考资料[1]）
FBDD筛选靶点
与前几年形成鲜明对比的是，上述20个优化案例中只有2个激酶靶点和1个蛋白酶靶点，而有9个案例说明FBDD成功靶向了其他酶领域。此外，FBDD衍生的蛋白-蛋白相互作用（PPIs）的抑制剂的数量也非常引人注目-有6个成功的非布罗莫结构域蛋白-蛋白相互作用研究案例，包括K-RASG12D，Mcl-1和TNF。在这几个案例中，K-RASG12D的工作形成了在细胞体系中研究K-RAS的生物抑制活性检测的探针，Mcl-1的工作为临床化合物S64315/MIK665的发现铺平了道路，而TNF的工作强调了PPIs变构调节抑制剂开发的多样性。尽管大多数的PPIs的开发是寻找抑制剂，但也有一些示例试图通过FBDD技术来稳定蛋白之间的相互作用，如片段衍生的14-3-3复合物与雌激素受体ɑ，以及KRAS-SOS1复合物稳定化开发工作。
另外，其他FBDD成功的靶点包括GPCR (mGluR2)和Apolipoprotein E4。后者的工作将稳定蛋白-蛋白相互作用的概念扩展到稳定单一纯化后的蛋白，而监测FBDD在这样非典型药物作用模式中的应用是有趣的。2019年另一个有意思的概念是基于磷酸酶PTPN5/STEP的片段酶活化剂的发现。片段衍生分子作为激酶的变构激动剂已被报道过，而阐明这种激活机制在科学上同样非常有趣。
表3：2015-2019年FBDD筛选靶点分类
（图片来源：参考资料[1]）
除上述提到的K-RASG12D外，2019年还有一篇关于另一个K-RAS突变类型即K-RASG12C的报道，该工作具有划时代的意义。该突变体中存在半胱氨酸，这提供了一个共价靶向的机会。Amgen和 Carmot Therapeutics采用Chemotype Evolution technology方法（化学型进化技术，一种FBDD方法）找到了针对细胞活化P2口袋的共价结合物。更重要的是，通过对这个结合物进行骨架跃迁产生了第一个针对K-RASG12C的临床抑制化合物（AMG510）。尽管严格来说这项工作不符合最初的筛选规则，但它确实完全符合FBDD技术原则，因此文章将此开创性工作突出展示。
图4：共价FBDD衍生的K-RASG12D抑制剂的发现
(图片来源：参考资料[1])
共价FBDD案例在过去几年一直有良好的应用，有趣的是，2019年两个案例阐述了两种不同实现共价FBDD的方法。前述K-RASG12C的工作是首先筛选亲电碎片库，再在此基础上进行片段优化，而Kallikrein 5的案例是先筛选非共价碎片库，再在优化过程中加入硼杂环亲电弹头最终得到共价先导化合物。这两种方法使得大量共价FBDD的案例产出，包括cysteine protease cathepsin L, fructose-1,6-bisphosphatase和 E3 Ubiquitin Ligase HOIP。另外，共价FBDD也经历了技术的进步，例如虚拟筛选设计工具CovaDOTS，亲电片段库设计，以及进行对映体探针对的全功能化片段(FFF)的方法扩展。
FBDD筛选方法
片段与靶点的结合力较弱，其结合常数Kd值通常在μM到mM级别，因此需求较为灵敏的检测方法。据报道，目前已有超过9种检测方法被用于FBDD的片段筛选阶段，其中许多在2019年的案例研究中都有所体现。2019年最流行的片段筛选方法是bioassay（24%），NMR（22%，包括ligand-observed NMR和 Protein-observed NMR），X-ray crystallography（14%）和Thermal shift assay（10%）。与2017和2018年相比，bioassay所含比例有所降低，而X-ray crystallography的占比一如既往的高，这可能反映了市场对X ray crystallography基础设施的重大投资情况。值得一提的是，同样有相当比例（10%）的片段起始点来源于文献。
在片段优化方面，现在普遍认为FBDD是需要晶体结构信息促进的，但在没有晶体结构信息的时候同样有其他可替代的解决方法。2019年案例中有5起片段优化案例是在没有晶体结构信息下进行的，约占总数的四分之一，这种情况与往年结果类似。
图5：2019年应用于FBDD的筛选技术（左图）
和2015-2019年应用于FBDD的筛选技术（右图）
（图片来源：参考资料[1]）
FBDD片段性质对先导化合物优化结果的影响
FBDD片段优化主要使用基团添加策略，包括片段连接，片段增长（融合）以及片段自组装等，因此需求片段具有一个较好的起点。目前，制药行业在进行片段库设计的时候除了满足基本的Ro3原则外，通常还会进行HAC，PSA，3D character等因素的考量，甚至建立相应的片段化合物库以满足筛选需求，提升片段优化的成功率。文章统计了20个2019年和131个2015-2019年fragment-lead分子对，主要对以下三个方面进行了探讨：
分子量和脂水分布系数。片段分子量范围为200-250 Da，优化得到的先导化合物分子量范围为350-400 Da，分子质量升高了约150 Da，与此同时，clogP升高了1个单位。
图6：2019年片段-先导化合物分子对分子性质（上图）
2015-2019年片段-先导化合物分子对分子性质（下图）
（图片来源：参考资料[1]）
配体效率（Ligand efficiency, LE）。文章对2015-2019的fragment-lead分子对的LE进行统计，发现片段的LE和对应的先导化合物的LE之间没有明显趋势，配体在优化过程中，其LE可以升高也可能降低。这意味着通过合适的优化，低配体效率的片段仍然能够产生高配体效率的先导化合物。因此配体效率不应该是片段选择唯一的考量因素。片段和先导化合物的配体效率在不同的靶点之间存在细微差别，其中激酶类最高（0.42和0.40），非布罗莫结构域PPIs最低（0.32和0.31），而蛋白酶（0.39和0.33），布罗莫结构域PPIs（0.42和0.35）和其他酶（0.40和0.40）介于中间。
图7：片段-先导化合物分子对配体效率，
不同颜色代表不同靶点
（图片来源：参考资料[1]）
3D特征（3D character）。分子的3D特征又称为“类天然产物性”，通常认为具有3D特征的化合物在筛选时候有潜在的好处（虽然缺乏实验依据）。从2015年到2019年积累数据显示，最终先导化合物的偏离平面性（DFP）独立于片段的DFP，且几乎总是大于片段的DFP。这表明片段在优化过程中变得更加“三维”。因此，片段库设计时候不一定需求很多3D特征的分子，筛选具有三维特性片段库的好处仍有待探索。
图8：2015-2019年片段-先导化合物分子对偏离平面性
（DFP），图中直线为片段和先导化合物偏离平面性一致
（图片来源：参考资料[1]）
结语
FBDD的广泛应用表明该方法日趋成熟，但许多论文同时表明FBDD仍是一门不断发展的学科，如片段合成中新反应和新技术（微流体和自动化）的应用，片段筛选中技术的发展（如Cryo-EM，XFELs和SFX）和拓展的碎片库的创新（如MiniFrag，FragLites）等，这些帮助我们分析片段与蛋白质的相互作用，反馈库设计信息，并告诉我们如何更有效的优化片段。因此，考虑到技术持续发展，文章认为FBDD会发展地越来越好。
根据FBDD设计原则，成都先导基于自有的DEL技术对片段化合物库进行了应用拓展，实验显示出良好的结果。另外，成都先导近期收购了英国Vernalis (R & D)，凭借其20年的FBDD和SBDD开发应用经验，必然有助于这些片段化合物快速优化成临床候选化合物，并最终加速新药项目产出。
参考文献：
[1] Wolfgang Jahnke et al., Fragment-to-Lead Medicinal Chemistry Publications in 2019. DOI:https://dx.doi.org/10.1021/acs.jmedchem.0c01608
[2] Harren Jhoti et al., Fragments: where are we now? DOI:https://doi.org/10.1042/BST20190694