科研 | Nature Communications：与心脏代谢相关的非保守lncRNA的体内功能分析
编译：风道恋海，编辑：十九、江舜尧。
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长链非编码RNA（LncRNA）是一种长度超过200个核苷酸的转录本，缺乏编码潜力，作为基因表达关键调节因子能够广泛表达。lncRNA发挥其功能的主要机制是与转录因子或染色质修饰复合物相互作用，以调节基因的转录。大多数人类的lncRNA在其一级序列中是非保守的，但研究表明某些非保守的人类lncRNA具有明显的功能。一般来说，基因组序列保守性低提示功能有限或缺乏，此外，lncRNAs的结构上而非序列上的保守性提示我们可能尚不了解其保守性的模式。本研究建立了一条实用的方法，用于研究人类非保守lncRNA的生理功能。首先通过全基因组关联分析（GWAS）肝脏代谢疾病，选择出一系列可能具有功能的lncRNAs。使用表观遗传标记、3-D染色质相互作用、肝脏富集、共表达功能预测以及体内代谢环境调节等进一步地筛选潜在功能性lncRNAs。最后该非保守性的人源化lncRNA可以在肝脏特异性人源化小鼠模型发挥调控和功能，该功能由与肥胖风险增加相关的GWAS基因座调控。
论文ID
原名：In vivo functional analysis of non-conservedhuman lncRNAs associated with cardiometabolic traits
译名：与心血管代谢相关的非保守lncRNA的体内功能分析
期刊：Nature Communications
IF：11.878
发表时间：2019.11
通讯作者：Haiming Cao
通讯作者单位：美国国立心、肺、血液病研究所
DOI号：10.1038/s41467-019-13688-z
实验设计
本研究首先通过全基因组关联分析（GWAS）肝脏代谢疾病，选择出一系列可能具有功能的lncRNAs。使用表观遗传标记、3-D染色质相互作用、肝脏富集、共表达功能预测以及体内代谢环境调节等进一步地筛选潜在功能性lncRNAs。进一步地，通过将lncRNA的相关生物途径整合到人类群体中以及将其共同调控的基因整合到人源化的小鼠模型中，进一步筛选lncRNA的功能和特定的靶基因。随后在人源化的小鼠模型中成功证实人特异性lncRNA的体内功能。最后，该研究表明与肥胖相关的人lncRNA通过与RNA结合蛋白HuR相互作用来调节人源化肝脏脂肪酸氧化中基因表达的预测功能。
结果
1 与人肝脏中心血管代谢相关的lnc-eGenes（eQTL调控的lncRNA基因）的鉴定及功能预测
首先研究者利用六种代谢疾病或性状的GWAS与在肝脏中eQTL的共同分析系统地绘制了人类lncRNA。综合了人类lncRNA annotation以及lncRNA Knowledgebase对人肝脏的RNA-seq进行分析，并通过HEIDI处理进行SMR分析以确定eQTL筛选的是具有功能的lncRNA而不只是GWAS连锁信号。最后鉴定了726个独特的lnc-eGenes，它在肝脏中的eQTL至少拟合一个GWAS的SNP（单核苷酸多态性），表明它们在肝脏中的表达可能与心脏代谢相关。然后通过表观遗传标记、3-D染色质相互作用、肝脏富集（图1B）、共表达模型进行功能预测（图1C）以及共表达模型中的编码蛋白质基因KEGG通路分析（图1D），进一步地筛选潜在功能性lncRNAs，并且这些与性状相关的lncRNA可能在多种代谢途径中起作用，包括脂肪酸代谢，类固醇生物合成，mRNA加工以及氨基酸代谢。
2 建立一个研究人肝基因对全身代谢信号响应的体内模型
由于筛选的大多数都是与性状相关的非保守的人类lncRNA，因此小鼠模型不适合研究其体内调节和功能。研究者试图建立一种肝脏人源化的TK-NOG小鼠模型。为了评估使用这种人源化小鼠研究非保守的人lncRNA的生理功能的可行性，研究者首先检查了人源化肝脏中的人类基因是否维持对代谢禁食等生理反应。通过对小鼠人源化肝脏和GTEx中人类肝脏的RNA-seq相关分析（图 2a），表明小鼠人源化肝细胞可以在转录水平上地反映人类肝脏中的肝细胞生物学特征。该小鼠模型在禁食条件下的生物合成途径，与已知人类的肝脏对禁食的反应完全一致（图2b）。最后使用人类特异性引物的qPCR进一步证实了这些途径中几个关键基因的表达变化（图2c）。
3 定义与性状相关的lncRNA的体内分子水平的功能
从以上研究分析结果，研究者把目光集中lnckb.42285（LINC01018），图3a结果显示LINC01018在肝脏组织中高表达。基于RNA-seq分析，在禁食小鼠人源化肝脏中检测到LINC01018被强烈上调，并且使用qPCR分析证实了这一结果（图3b）。综上，LINC01018是一种与代谢性状相关，其可能在禁食小鼠的肝脏代谢途径中起调节作用。通过集中相关分析发现LINC01018可能在脂肪酸降解，过氧化物酶和丁酸酯代谢中起作用，并且这些结果与观察到的禁食使LINC01018上调的现象一致（图3c）。为了检测LINC01018在体内对这些潜在靶基因的调控，研究者利用shRNA特异性阻断LINC01018在小鼠人源化肝脏中的肝表达（图3d）。最终发现敲除LINC01018导致ADH1C，CYP4A11和CYP4A22的表达降低，这是脂肪酸代谢ω-羟基化途径中的关键基因，以及丁酸代谢途径中的BDH1和ALDH5A1（图3d）。此外作者也证明了LINC01018对以上基因表达的调控与遗传背景无关（图3e）。
4 HuR介导LINC01018的调节作用通过在体内与其相互作用
为了进一步探索LINC01018在体内调节基因表达的分子机制，研究者使用生物素标记的LINC01018和来自小鼠人源化的肝组织裂解液进行了lncRNA Pulldown实验，通过质谱法鉴定LINC01018富集的人蛋白质。并且利用蛋白质免疫印迹法确定LINC01018与HuR蛋白结合（图4a）。进一步地利用蛋白质免疫共沉淀确定了小鼠人源化肝脏中内源性HuR与LINC01018之间的相互作用（图4b）。使用腺病毒shRNA在人源化小鼠肝脏中分别敲低HuR蛋白或者敲低LINC01018和HuR蛋白，LINC01018调控基因表达水平不同程度的降低（图4c 和4d），这些数据支持LINC01018至少部分以依赖于HuR的方式行使其调节功能。在野生型小鼠中使用shRNA敲低鼠源的HuR后， CYP4A11，ADH1C和ALDH5A1人源基因的小鼠同源物（Aldh5a1，Adh1，Cyp4a12a和Cyp4a12b）的表达水平显著降低（图4e），表明在小鼠HuR对LINC01018靶基因的调节具有保守性。接下来，利用shRNA将人源的LINC01018在野生型小鼠肝脏中表达，免疫共沉淀分析表明LINC01018可以有效结合小鼠HuR蛋白。并且高表达LINC01018的小鼠肝脏组织中的Cyp4a12a，Cyp4a12b和Aldh5a1的表达水平升高，而Adh1的表达也有增加的趋势（图4f），这表明LINC01018 可以调节小鼠肝脏中的HuR活性。 HuR最完善的功能之一是通过与mRNA相互作用来稳定它们。
为了直接测试LINC01018是否可以调节小鼠的HuR活性，研究者使用免疫共沉淀分析LINC01018表达小鼠肝脏，发现HuR及其靶标mRNA的相互作用（如图4g）。这表明LINC01018能够促进HuR与其靶mRNA的结合，因此潜在地增加了这些mRNA的稳定性。为了清楚地证明LINC01018-HuR复合物具有稳定这些mRNA水平，研究者在HEK293A细胞中过表达人CYP4A11和LINC01018和HuR的组合，并进行了放线菌素D处理以确定RNA降解的速率。结果表明CYP4A11的降解速率显著降低（如图4h）。这些数据进一步支持LINC01018通过调节HuR的活性来调节其靶基因的mRNA稳定性。综上，LINC01018作为非保守的人lncRNA，调节HuR的保守功能以调节代谢基因表达。
讨论
人类lncRNAs是从人类基因组转录而来的，但只有很小一部分被赋予了功能。目前，大多数人类lncRNA被认为是非保守的，这使得筛选具有潜在功能的lncRNA并在体内鉴定其功能极为困难。本文研究者开发了一个方案来同时解决这两个挑战，这可以显着加快功能性人类lncRNA的发现。通过该方案，研究者提供了原理上的证明，即此类lncRNA （LINC01018）在体内调节肝脏代谢基因的表达，并进一步证明了LINC01018与HuR相互作用以发挥其功能。该项工作开辟了一条新途径，以评估非保守人类lncRNA的功能重要性，并揭示人类生物学中新的lncRNA介导的机制。
目前科学家对lncRNA功能的了解仍然偏少，并且lncRNA在功能上的保守性可能与目前蛋白质的编码基因的评估方案不吻合。基于细胞的研究中鉴定的功能性lncRNA数量的增长，提示一些非保守的人lncRNA可能具有人源的特有的功能。但是目前缺乏有效生物信息学策略来识别lncRNA功能性，因此作者优化了一种可识别可能起作用的人lncRNA的筛选策略，并提供尽可能多的功能推断以简化其下游分析。本研究首先通过全基因组关联分析（GWAS）肝脏代谢疾病，选择出一系列可能具有功能的lncRNAs。使用表观遗传标记、3-D染色质相互作用、肝脏富集、共表达功能预测以及体内代谢环境调节等进一步地筛选潜在功能性lncRNAs。需要注意的是，研究这些lncRNA在体内功能时，其代谢环境是在人类遗传背景下（由来自单个供体的肝细胞生成的人源化小鼠）进行的，这对lncRNA在体内的功能分析非常有益。结合这些广泛的分析，本研究确定了一组具有多种功能指标的与代谢性状相关的人类lncRNA，这使得lncRNA功能分析能被广泛应用。
当前，研究人类lncRNAs最具挑战性的方面应该是缺乏定义其生理功能的实验系统。由于大多数人类lncRNA是人类或灵长类动物特异性的，因此通常只能在人类系统中进行研究。但是，大多数肝相关细胞系或原代肝细胞通常与人体天然生理条件下存在的肝细胞存在很大差异，因此无法可靠地模拟许多体内机制。为了应对这一挑战，研究者采用了肝脏特异性的人源化小鼠模型来研究人类lncRNA，并成功鉴定出非保守人类lncRNA的特异性功能。有趣的是，本研究无法在原代肝细胞中检测到该lncRNA的类似功能影响，这一结果与前人在小鼠lncRNA研究结果一致。这些发现共同支持一个体内系统对于定义非保守人类lncRNA基因的生物学作用至关重要，而且该基因占据了人类基因组的很大一部分。
当然，人源化肝脏只是肝细胞被部分人源化的嵌合肝脏，小鼠肝细胞或其他细胞的比例可能会影响实验结果的准确性。另外，人源化的小鼠缺乏人的激素系统，可能不适合研究其功能需要这种激素信号相关的人lncRNA。又因为用于人类肝细胞移植的小鼠是免疫缺陷的，该模型不适合研究与肝脏早期成熟相关lncRNA（因为免疫力和新陈代谢高度相关）。目前本研究的人源化肝脏模型仅是人类肝脏的近似模型，可能仅适合于研究人类肝脏代谢的某些方面。人类特有的lncRNA与蛋白质以及其他编码和非编码RNA形成了一个相互连接的网络，其复杂性超出了现有体外系统可以模拟的能力。因此，人源化小鼠可能是目前唯一直接研究人特异性lncRNA生理功能的可行系统。与非人类灵长类动物相比，它还具有预测实验治疗对人类特异性毒性的优势，有时可以提供挽救生命的信息。
最后，本研究策略可能对理解人类生物学，生理学和疾病具有重要意义。非保守的人类lncRNA的数量已经超过了mRNA的数量。研究结果显示出一部分lncRNA在体内具有功能，这表明对非保守人类lncRNA的功能分析可以为生物学和生理学提供许多基本的预测。此外，使用本策略研究非保守的人lncRNA，还可以系统地确定人类生理学独特的调节机制。基因组中的非编码区可能在许多方面决定生物体的复杂性，而lncRNA可能在物种特异性调控中发挥重要作用。因此，研究人源lncRNA可能会提供一个系统地发现人体生物学的机会，这也可以对人生理学和疾病的更好理解。
评论
大多数人类lncRNA是非保守的，这使研究具有潜在功能的lncRNA富有相当大的挑战性。本文研究者优化了全基因组关联分析（GWAS）筛选出具有生物学功能人lncR NA的策略，并提供尽可能多的功能推断以简化其下游分析。进一步地，通过肝脏特异性人源化小鼠模型研究相关lncRNA发挥调控和功能，最后证明了LINC01018与HuR相互作用以发挥其功能。结合这些广泛的分析，确定了一组具有多种功能指标的与代谢性状相关的人类lncRNA，这使得lncRNA功能分析能被广泛应用。研究这些lncRNA在体内功能时，其代谢环境是在人类遗传背景下（由来自单个供体的肝细胞生成的人源化小鼠）进行的，这对lncRNA在体内的功能分析非常有益。当然，人源化肝脏只是肝细胞被部分人源化的嵌合肝脏，小鼠肝细胞或其他细胞的比例可能会影响实验结果的准确性。总的来说，该项工作开辟了一条新途径，以评估非保守人类lncRNA的功能重要性，并揭示人类lncRNA介导调控的新机制。
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