综述 | Trends in Pharmacological Sciences：慢性阻塞性肺疾病的RNA治疗策略
编译：怀瑾，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Therapeutic RNA strategies for chronic obstructive pulmonary disease
译名：慢性阻塞性肺疾病的RNA治疗策略
期刊：Trends in Pharmacological Sciences
IF：11.523
发表时间：2020.05
通讯作者：W.S. Fred Wong
通讯作者单位：新加坡国立大学卫生系统，Yong Loo Lin医学院药理学系
DOI号：10.1016/j.tips.2020.04.007
图1
主要内容
1.治疗现状及前景
劳累性呼吸困难可能是疾病早期的唯一特征，而右心衰竭症状（例如肺心病）在疾病晚期较明显。吸烟是COPD的主要原因。而在发展中国家，用于烹饪和取暖的生物质燃料所造成的环境污染，职业化学暴露和家庭空气污染等在COPD的发病过程中也起重要作用。
支气管扩张剂是当前COPD对症治疗的基础，包括毒蕈碱拮抗剂和β2-激动剂，在治疗时单独或组合使用。有研究建议可将吸入性类固醇（ICSs）和罗氟司特（Roflumilast）与支气管扩张药组合应用，以进一步减缓病情，但这些新型药物会不可避免地产生副作用。安全有效的COPD药物治疗仍面临重大挑战，主要原因是未完全了解疾病发展的病理生理机制。临床上迫切需要鉴定出在COPD中驱动炎症、实质破坏、粘膜纤毛功能障碍和纤维化过程的关键治疗靶点，制定治疗策略以阻止肺功能下降和治疗合并症（如肺动脉高压）。
RNA药物在由小分子和蛋白质生物制剂主导的疾病治疗领域有很大的竞争潜力。RNA疗法具有高度特异性，可作为基因疗法可逆性替代，且安全性更高。七种基于寡核苷酸的药物已获批，许多RNA候选药物也正在临床试验中。高通量测序技术的最新进展揭示了非编码转录组的深度和复杂性，ncRNA（如miRNA和lncRNA）的表达失调与COPD的发展密切相关，提示ncRNA可作为治疗干预的潜在新靶标。
表1 已在COPD模型中验证的潜在miRNA疗法
2.靶向miRNA
miR-3202血浆水平在吸烟者（伴或不伴有COPD）中被下调。在人支气管上皮细胞（HBEC）和原代人T细胞的共培养体系中，香烟烟雾提取物（CSE）可减少miR3202的表达，但增加干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α、基质金属蛋白酶（MMP）9和T细胞中血管内皮生长因子（VEGF）的水平，并诱导HBEC凋亡。在CS持续诱导一个月的COPD大鼠模型中，随着IFN-γ和TNF-α的产生以及气道炎症的增加，肺组织中miR-3202显着下降。在暴露于CSE的T细胞和暴露于CS的肺组织中，miR3202的靶基因FAS凋亡抑制分子（FAIM）2的表达上调。FAIM2介导FAS和FAS配体（FASL）失活，以抑制T细胞凋亡并促进COPD气道炎症永久化。在共培养体系中使用miR-3202模拟物或FAIM2特异性siRNA，结果显示FAIM2表达，MMP9、VEGF、IFN-γ和TNF-α的产生以及HBEC凋亡均下调，同时FAS和FASL表达增加。
血浆和肺组织水平miR-206在COPD中上调，并且与预测的呼气量（1 s）（FEV1）呈负相关。在人肺微血管内皮细胞（HPMEC）中，CSE暴露可增加miR-206表达，caspase 3活性和细胞凋亡。生物信息学分析显示，Notch3和VEGF-A是miR-206的直接靶基因，COPD肺样本中miR-206表达与Notch 3和VEGFA水平之间呈负相关。Notch 3可促进人肺动脉平滑肌细胞（PASMC）的合成和增殖，而VEGF-A可诱导内皮细胞增殖，粘附和血管形成，暗示它们在COPD的血管重构中具有潜在作用。miR-206拮抗剂可增加HPMEC中Notch 3和VEGF-A的表达，并抑制CSE诱导的caspase 3/9表达、B细胞淋巴瘤（Bcl）-2下调和HPMEC凋亡。
肺部样本中miR-195表达在COPD中明显上调，且与磷酸化Akt水平呈正相关，但与预测的FEV1％负相关。miR-195可与PH结构域富含亮氨酸重复序列的蛋白磷酸酶2（PHLPP2）mRNA的3' UTR结合，导致PHLPP2蛋白表达下调并因此激活Akt。在慢性CS诱导的15周COPD小鼠模型中鼻内施用抗miR-195慢病毒，能够降低肺组织中磷酸化Akt的表达、中性粒细胞和巨噬细胞的浸润、肺实质破坏以及支气管肺泡灌洗（BAL）液中IL-6和TNF-α。
miR-145-5p血浆水平在吸烟者（伴或不伴有COPD）肺部样本以及暴露于CSE的HBEC中下调。据推断miR-145-5p通过抑制p53和裂解的caspase 3/9表达以控制细胞凋亡和炎症。它与Kruppel样因子5（KLF）mRNA的3'UTR结合以下调KLF5基因表达。已发现在COPD中KLF5水平被上调，其在CS诱导的COPD中的病理机制是通过促进核因子（NF）-κBp65亚基的核易位，导致IL-6，IL-8和TNF-α水平升高。miR-145-5p模拟物可有效降低KLF5、p53、裂解的caspase 3/9表达，NF-κBp65亚基的核易位和暴露于CSE的HBEC中促炎因子的产生。
miR-181c水平在吸烟者（伴或不伴有COPD）肺部样本,暴露于CSE的HBEC以及慢性CS诱导的6个月COPD小鼠模型的肺组织中下调。miR-181c与细胞通讯网络因子1（CCN1）mRNA的3'UTR互补结合，降低其基因表达。经鼻内给予miR-181c模拟物可抑制COPD小鼠中CCN1水平，降低CS诱导的巨噬细胞和中性粒细胞数以及BAL液中IL-6和IL-8。
miR-27-3p在CS暴露的小鼠初级肺泡巨噬细胞和肺组织中的表达高度上调。miR-27-3p结合过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ的3'UTR序列，以沉默其基因表达，从而导致肺泡巨噬细胞极化为M1型，并上调Toll样受体（TLR）2/4及其下游信号分子（包括JNK/p38 MAPK，JAK/ STAT，NF-κB通路）。miR-27-3p拮抗剂可有效逆转促炎过程的激活，并减轻CS诱导的中性粒细胞和巨噬细胞的肺浸润及BAL液中炎症因子（如IL-1β，TNF-α和IFN-γ）的水平。
3. siRNA的治疗潜力
表2 已在COPD模型中验证的潜在siRNA疗法
3.1 NF-kB及相关因子
NF-κB是促炎基因转录的主要开关，已被证明在COPD肺气道上皮和肺泡巨噬细胞中被激活。受体相互作用蛋白（RIP）2（介导蛋白与NF-κB的相互作用并激活其转录活性）在CS诱导的COPD小鼠模型中表达上调。气管内RIP2特异的siRNA能够降低肺RIP2水平并降低NF-κB活性，同时减少气道上皮增厚、中性粒细胞浸润、促炎性细胞因子生成和氧化应激标志物升高。核糖体蛋白（RP）S3被证明是NF-κB复合体的一部分，可促进NF-κB核积累和DNA与κB位点的结合以激活转录。在CS诱导的COPD小鼠模型中，肺中RPS3的水平上调。气管内RPS3特异的siRNA能够降低肺RPS3水平并减少NF-κB核易位，同时减少一系列炎症反应。MAP3K19是一种新型的丝氨酸/苏氨酸激酶，在支气管上皮细胞，肺泡和间质巨噬细胞中表达最高。MAP3K19促进活化的p-Smad2 / 3核易位并激活NF-κB。在CS诱导的COPD小鼠模型中，气管内MAP3K19特异的siRNA能够减少肺部中性粒细胞的浸润和BAL液中KC（人IL-8的小鼠同源物）水平。IL-32是一种主要在免疫细胞中表达的促炎细胞因子，并在肺和支气管上皮细胞等多种器官中广泛表达。通过NF-κB通路在COPD中诱导促炎细胞因子的产生。在健康非吸烟者的初级肺泡巨噬细胞中，IL-32特异的siRNA能够抑制CSE诱导的IL-32蛋白表达以及IL-6和TNF-α的产生。
3.2 黏液分泌相关因子
黏膜纤毛功能障碍是导致COPD气流阻塞的因素之一。杯状细胞增生和黏液过表达是COPD肺部病理的标志性特征。CD147是一种质膜蛋白，通过激活p38 MAPK和诱导MMP9参与黏液合成。MUC5AC粘糖蛋白是粘液的主要成分，可由CS诱导。研究显示MMP9可以裂解表皮生长因子受体（EGFR）配体，从而释放EGFR配体以激活EGFR和产生MUC5AC。使用永生化HBEC，CD147特异的siRNA降低了 CSE诱导的MUC5AC产生，同时降低MMP9和p38 MAPK。大规模的全基因组关联研究（GWAS）表明，PTCH1是驱动 COPD和肺功能损害的重要因素。激活PCTH1受体可促进细胞增殖。COPD患者气道上皮中PTCH1蛋白上调，并伴有粘液分泌增加和上皮细胞层增厚。在人上皮细胞系NCI-H292中，PTCH1特异的siRNA显着阻断EGF诱导的MUC5AC基因表达。
3.3 COPD恶化相关基因
COPD的恶化通常由上呼吸道感染病毒和/或细菌引起，进一步将导致肺功能恶化和死亡率增加。IL-17C是IL-17细胞因子家族的成员，主要在上皮细胞中响应TLR2和TLR5的活化。最近研究表明，人类鼻病毒（HRV）和嗜血杆菌流感（NTHI）（这是导致严重COPD恶化的常见原因）感染后，从COPD患者中分离的原发性HBEC中IL-17C的产生增加。在COPD恶化期间HMGB1的血浆水平显着增加。HMGB1是一种核蛋白，参与染色质结构和基因表达的调节，在感染和损伤后释放到细胞质，然后分泌到细胞外空间。它与模式识别受体如TLR2，TLR4和Dectin-1结合，诱导炎性因子的产生。从CS小鼠分离的原代肺泡巨噬细胞经体外感染烟曲霉，HMGB1特异的siRNA能够减少细胞因子的产生，同时下调TLR2 / 4和Dectin-1以及下游信号分子（MyD88和NF-κB的p65亚基）。
3.4 气道重塑相关因子
COPD的气道重塑涉及气道上皮和平滑肌细胞增生，并伴有失衡的细胞外基质（ECM）沉积到肺间质中，导致肺纤维化和呼气流量受限。研究表明，versican在人类慢性肺部疾病中积累，其主要来源于COPD患者的原代成纤维细胞。versican特异的siRNA可增加原代成纤维细胞中的弹性蛋白，可能有助于COPD中弹性蛋白组织的修复。碳水化合物磺基转移酶（CHST）3是CSPG合成途径的关键酶。在猪胰腺弹性蛋白酶诱导的肺气肿小鼠模型中，腹膜内给予CHST3 siRNA能够减少CSPG沉积，改善肺气肿并保留肺功能。滋养层细胞表面抗原（TROP）2是I型跨膜糖蛋白，表达于肺基底隔室中的多功能祖细胞，在COPD肺中表达量升高。TROP2特异的siRNA降低基底细胞增生和上皮-间质转化(EMT)，表明在预防COPD气道重塑方面具有潜在的治疗价值。
3.5肺血管重建相关因子
肺心病是晚期COPD并伴有肺动脉高压患者的常见并发症，由CS暴露和低氧血症诱导的肺血管壁重塑所致。神经元衍生的孤儿受体（NOR）1是一种核受体，在调节炎症和血管重塑方面，作为配体非依赖的转录因子和早期反应基因发挥作用。在低氧血症的COPD患者的肺血管中，发现 NOR1过表达，并伴有细胞周期蛋白D1，缺氧诱导因子（HIF）-1α，平滑肌肌动蛋白（SMA）和血管壁厚度的增加。在原代人PASMC中，NOR1特异的siRNA能够抑制缺氧诱导的细胞周期蛋白D1水平，DNA合成和细胞增殖。S100A4是S100钙结合蛋白的分泌成员，参与平滑肌细胞的迁移和增殖以及EMT。在原发性人PASMC中，靶向HIF-1α或HIF-2α的siRNA能够减弱缺氧诱导的S100A4上调，提示S100A4可作为COPD中血管重构的潜在治疗靶点。结缔组织生长因子（CTGF）介导成纤维细胞和平滑肌细胞增殖和ECM合成。CTGF特异的siRNA能够阻断CSE诱导的人原代PASMC中细胞周期蛋白D1和下游效应子E2F水平的增加，从而导致细胞周期停滞在G0期。
4.靶向lncRNA
多项GWAS和基因组失衡研究已经确定了许多与COPD相关的lncRNA，然而只有少数lncRNA被验证为COPD的潜在治疗靶点。研究表明，在COPD患者的痰细胞和肺组织、CSE刺激的原代人成纤维细胞和支气管上皮细胞、CS诱导的COPD小鼠的肺组织中，lncRNA牛磺酸上调基因1（TUG1）被上调。 TUG1的上调与预测的FEV1％负相关，与气道炎症和重塑呈正相关。TUG1通过下调miR-145-5p发挥作用，miR-145-5p可沉默靶基因DUSP6。鼻内给予表达靶向TUG1短发夹RNA（shRNA）的慢病毒载体，可阻断CS诱导的COPD小鼠模型中气道炎症和重塑。
巨噬细胞在COPD的发病机制中起关键作用，M1巨噬细胞（促炎性）和M2巨噬细胞（抗炎性）表型之间的极化决定疾病状态。研究表明，COPD患者的外周血单核细胞（PBMC）表现出更多的由粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导的M1表型，从而上调NF-κBp65亚单位依赖性的lncRNA MIR155HG 和促炎因子（如TNF-α，IL-1β和IL-12）的表达。利用靶向MIR155HG的siRNA，巨噬细胞极化从M1型转变为M2型，同时减少促炎细胞因子。
结论与讨论
RNA是COPD药物开发的重要资源，并且随着RNA生物学研究的迅速转变，在不久的将来，可实现针对COPD的临床有效RNA疗法。
目前科学家致力于开发用于COPD的RNA疗法，但严重驱动COPD病理生理的生化途径仍然不清楚。虽然已经在COPD模型中成功验证了许多siRNA，考虑到COPD发生发展过程的复杂性，很少有靶向单基因的siRNA成功转化为有效的疗法。研究者们结合高通量RNA测序和生信分析，正在努力构建lncRNA–miRNA–mRNA网络，以帮助确定ncRNA在COPD中的调节作用。此外，由于ncRNA可同时调节多个基因，需采取特殊的预防措施以最大程度地减少脱靶副作用。
通过吸入将RNA治疗剂直接递送至肺部是减少全身性药物不良反应的最佳给药途径。但RNA分子的稳定性和递送系统仍然是临床成功的主要障碍。研究者正积极寻求技术的进步，并进一步完善递送系统，以期尽快实现临床转化。
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