科研 |SCIENCE：脊椎动物视网膜再生的基因调控网络
编译：六单元，编辑：景行、江舜尧。
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在部分冷血脊椎动物中，损伤会引起视网膜米勒神经胶质细胞再生成为神经元从而实现对视网膜损伤的修复，但遗憾的是，在哺乳动物中几乎不存在这种现象。为了研究冷血脊椎动物中米勒神经胶质细胞重编程成为祖细胞的基因调控网络，本研究融合bulk-seq、scRNA-seq和ATAC-seq技术，分析了斑马鱼、鸡和小鼠在不同刺激下，米勒神经胶质细胞的基因表达和染色质可及性的变化。通过比对，确定了不同物种间胶质细胞静息状态、重激活、神经再生的保守性和物种特异的基因调控网络。在斑马鱼和鸡中，胶质细胞由静息状态向重激活状态的转变是视网膜再生的必要条件，然而在小鼠中特定的基因网络抑制了神经元再生的能力并且在损伤后使得视网膜重新恢复到静息状态。进一步研究发现，在成年小鼠视觉受损以后，敲除调控维持和修复静息状态的核因子I（nuclear factor I, NFI）的转录因子会介导米勒神经胶质细胞增殖并产生新的神经元。
论文ID
原名：Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration
译名：脊椎动物视网膜再生的基因调控网络
期刊：Science
IF：41.8
发表时间：2020年10月
通讯作者：Seth Blackshaw
通讯作者单位：约翰霍普金斯大学医学院
DOI号：10.1126/science.abb8598
实验设计
结果
为了确定小鼠和斑马鱼中米勒神经胶质细胞进行重编程的核心调控网络，研究人员设置了两种损伤模型：光损伤组（外层视网膜损伤）和天冬氨酸（NMDA）处理组（内层视网膜损伤）。在损伤后不同的时间点利用流式分选出米勒神经胶质细胞，利用这些细胞构建了100束RNA-seq文库和40个ATAC-seq文库。利用主成分分析（Principal component analysis，PCA）发现NMDA处理组和光损伤组表现出物种特异性的转录组差异。在小鼠模型中，米勒神经胶质细胞的转录组变化发生时间较短，3小时以内即产生，但很快恢复到静息状态（图1. A）。然而，在斑马鱼中，无论是哪一种处理都会促使米勒神经胶质细胞逐渐背离静息状态（图1. B）。
研究人员在小鼠中发现了2198个两种不同处理下共同的差异表达基因，在斑马鱼中则有1600个。这些差异表达基因可以分为三组：第一组主要在静息的米勒神经胶质细胞中表达，损伤产生后重新被抑制，剩余两组依次表现为快速和缓慢的损伤依赖诱导。利用GO分析可以发现这些差异表达基因表现出物种特异性的差异。例如，快速诱导的小鼠米勒神经胶质细胞基因包括TNF、MAPK、NFKB和Hippo信号通路中的相关基因，然而在斑马鱼中，则主要富集在核糖体合成相关的基因。缓慢诱导组的小鼠基因主要在核糖体合成进行富集，斑马鱼则主要在细胞周期相关功能进行富集，暗示斑马鱼米勒神经胶质细胞在光损伤25小时后会重新进入细胞周期。
为了确定在米勒神经胶质细胞中差异基因的物种特异性，研究人员比较了斑马鱼和小鼠的差异基因并且将它们分成了三类（图1. G和H）。主要包括547个其他物种中不存在同源基因，2483个物种存在同源基因但物种特异性表达的基因和354个两个物种间不同损伤模式下引起的差异表达基因。另外，还确定了368个基因，这些基因在损伤后并没有引起差异表达，但这些基因在小鼠和斑马鱼的米勒神经胶质细胞中本地的表达水平却有显著性的差异。
图1. RNA测序分析斑马鱼和小鼠米勒神经胶质细胞。（A和B）小鼠和斑马鱼RNA测序数据的主成分分析。（C和D）差异表达基因的表达谱。（E和F）差异表达基因的功能富集。（G）差异表达基因和物种特异表达基因的举例。（H）小鼠和斑马鱼差异表达基因的比较。
2 ScRNA-seq分析斑马鱼、鸡和小鼠视网膜
为了全面分析米勒神经胶质细胞重编程的关键调控基因，研究人员构建了小鼠、斑马鱼和鸡在NMDA或者光损伤后的视网膜单细胞测序数据库。同时还设置了一些非损伤性的诱导重编程的条件进行对照，例如在斑马鱼中加入TNFα和γ分泌抑制剂（T+R处理），在鸡中加入FGF2和胰岛素。在小鼠中，尝试了FGF2和胰岛素联合NMDA处理的方式，能引起有限的增殖但无法诱导神经元的再生。总而言之，研究获得了77624个小鼠细胞，85051个鸡的细胞和105666个斑马鱼细胞的单细胞测序数据。
利用不同物种中已知的视网膜细胞的分子标记，研究人员将这些细胞分为不同的细胞群（图2.A至D）。在本研究的数据中，鉴定得到了每一个物种的主要的视网膜细胞类型，包括斑马鱼中表达nr2e3和neurod1的rod特定的祖细胞。Rod祖细胞在NMDA和光损伤处理后依次含有101和195个差异表达基因，其中97%和92%的差异表达基因在米勒神经胶质细胞损伤中同样存在。通过单细胞测序分析，还确定了在不同处理下，三个物种中存在的静息和激活状态的米勒神经胶质细胞。相比于完整的视网膜细胞中的丰度，米勒神经胶质细胞的占比是相对过量的，在斑马鱼、鸡和小鼠中分别达到了25.8%、38.2%和16.7%，可能反应了细胞存活和捕获效率的偏向性。
最后，研究通过比较转录组确定了在所有三个物种中每一个视网膜细胞类型保守和特异的分子标记基因（图2.E）。利用smFISH技术确定Mlc1/MLC1/mlc1和Inhba/INHBA/inhbab在三个物种的米勒神经胶质细胞中是选择性表达的。Cav2/cav2则选择性的在小鼠和斑马鱼米勒神经胶质细胞中表达（图2.F）。
图2. 单细胞测序分析小鼠、鸡和斑马鱼视网膜。（A）NMDA处理后小鼠视网膜细胞的分群。（B）小鼠视网膜细胞标记基因的表达。（C和D）NMDA或生长因子处理后鸡和斑马鱼视网膜细胞的分群。（E）细胞特异的标记基因。每一列代表一个单独的细胞类型。（F）smFISH展示斑马鱼、鸡和小鼠米勒神经胶质细胞中Mlc1/MLC1/mlc1的表达。斑马鱼中对谷氨酰氨合成酶（由glua/b基因编码）进行免疫染色。标尺为50μm。BC，双极细胞；AC，无长突神经细胞；RGC，视网膜神经节细胞；V/E细胞，血管/内皮细胞；RPE，视网膜色素上皮细胞；NIRG，非星形视网内膜胶质细胞。
3 米勒神经胶质细胞重编程的轨迹分析
利用单细胞测序的数据，研究人员构建了不同刺激下米勒神经胶质细胞的轨迹分析。和bulk测序的数据一致（图1.A），在NMDA和光损伤处理后，小鼠米勒神经胶质细胞的基因表达表现出快速的变化，随后又迅速恢复到静息状态（图3.A和B）。相反，斑马鱼米勒神经胶质细胞则表现出梯度的损伤诱导依赖的转录本变化（图3.C）。T+R处理组产生的基因表达变化类似于损伤产生的。在斑马鱼轨迹分析中，研究人员发现在损伤或T+R处理之后都会产生一个分支，这个分支富集了一些和重激活状态相关的基因，比如manf。然而，轨迹主干表现出神经再生、增殖相关的基因表达逐步上调的趋势，例如ascl1a和pcna。RNA速率分析表明，在NMDA处理以后，米勒神经胶质细胞由静息状态向重激活状态转变，并且随后进行增殖或者转换为静息状态（图3.C）。在对鸡进行NMDA或者FGF2加胰岛素处理以后，可以发现类似的现象（图3.D）。下一步，研究人员对损伤处理后不同物种间米勒神经胶质细胞基因表达谱的差异度进行了计算。结果表明，和斑马鱼、鸡增殖状态下的米勒神经胶质细胞类似，来源于斑马鱼和小鼠的静息以及活化状态下的米勒神经胶质细胞相似度较高。这些结果说明，斑马鱼和鸡的米勒神经胶质细胞的重编程状态是先经过一个重激活的状态才实现的。
单细胞测序的结果显示在光损伤和NMDA处理之间斑马鱼有67.7%的差异表达基因是重叠的，而小鼠中则是有48.4%。和鸡的NMDA以及FGF2加胰岛素处理一样，斑马鱼T+R处理和所有的损伤处理类似。研究人员确定了进化上保守的差异表达基因，包括Rlbp1/RLBP1/rlbp1a，同时也确定了物种特异的差异表达基因，例如小鼠的Rela/b和斑马鱼的lin28a（图3.E和F）。GO分析对这些保守和特异的差异表达基因的功能进行了富集。
图3. 小鼠、鸡和斑马鱼米勒神经胶质细胞的轨迹分析。（A）NMDA处理后小鼠米勒神经胶质细胞（MG）的轨迹。插图显示MG的拟时序。GF，生长因子（FGF2和胰岛素）处理。（B）小鼠MG拟时序的定量分析。（C和D）NMDA处理后鸡和斑马鱼MG的轨迹。箭头代表通过RNA速率分析确定的MG转换的方向。（E和F）小鼠和斑马鱼差异表达基因的表达情况。左边的彩色标签表示附图6D中保守的和物种特异的差异表达基因的分类。（G）斑马鱼发育过程中视网膜细胞的分群.（H）斑马鱼发育和NMDA处理后视网膜组细胞和MG的轨迹。图中显示了受精后的时长（hpf）。（I）发育和NMDA处理后MG的共同的差异表达基因的拟时序表达。列代表拟时间中的细胞。行代表在MG发育过程中（胚胎到成年）和NMDA处理（对成体进行NMDA处理）基因表达的变化。
4 比较斑马鱼米勒神经胶质细胞的重编程和发育过程
为了检测米勒神经胶质细胞起源的祖细胞转录本和正常视网膜发育过程中的祖细胞是否相似，研究人员比较了发育中的斑马鱼视网膜和重编程过程中的米勒神经胶质细胞的单细胞测序结果。和本研究前期小鼠的结果一致，在发育中的斑马鱼视网膜中，研究人员找到了两种转录水平有显著差异的祖细胞：初级和神经性视网膜祖细胞（图3.G）。将所有的祖细胞和米勒神经胶质细胞组合起来进行轨迹分析。NMDA、光损伤和T+R处理都会诱导米勒神经胶质细胞进入类似于多能视网膜祖细胞的状态，但是也会诱导产生有再激活的米勒神经胶质细胞组成的分支（图3.H）。在发育和重编程过程中，可以明显观察到部分差异表达基因有重叠现象。随着发育相关的基因例如ascl1a表达量的减少以及重编程中米勒神经胶质细胞的增加，大部分重叠基因（83.8%）在发育和NMDA处理过程中表现出负相关性，反之亦然。这些结果表明，在第一次通过再激活状态后，米勒神经胶质细胞是通过重新绘制与胶质细胞发生相关的基因表达的时间谱来实现重编程的。
图4. 米勒神经胶质细胞的ATAC测序分析和基因调控网络。（A和B）NMDA处理后，斑马鱼和小鼠损伤抑制的（灰色）、快速诱导的（蓝绿色）和缓慢诱导（橙色）基因的染色质开放性的变化。直线代表不同的开放性区域，它们被每组中和基因表达的正负相关性分隔开。（C和D）在斑马鱼和小鼠中，包括转录因子在内的候选基因分为十个模块。所有刺激条件下米勒神经胶质细胞50种分格的单细胞测序表达谱。（E和F）斑马鱼和小鼠模块间的调控网络。彩色圆圈代表不同的模块。连线表明不同模块间有显著的调控关系。（G）斑马鱼和小鼠的调控模式。（H）斑马鱼（ZF）和小鼠（MM）基因功能的比对。色彩代表不同的模块。黑色圆圈表示在所示物种的调控中不存在该基因。圆的大小代表基因表达的倍数或者基因调控的数量。空心圆代表处理后表达下降。
5 米勒神经胶质细胞重编程的基因调控网络
为了检测米勒神经胶质细胞的染色质可及性的变化，研究对损伤后的斑马鱼和小鼠进行了ATAC-seq分析。从NMDA和光损伤的样品中鉴定到差异可及性染色质区域（DARs），其中96%的小鼠和90%的斑马鱼区域来自于启动子、内含子和基因间隔区。结果表明，染色质可及性和基因表达的变化是有关联的（图4.A和B）。研究人员还观察到损伤后染色质可及性的物种特异的变化（图4.A和B）。例如，在斑马鱼中ascl1a的启动子在损伤后开放性增强，但小鼠中并没有发生。同样，发现在损伤后小鼠特异的基因开放性的增加，例如Rel。
为了整合基因表达和染色质可及性的数据从而重构调控米勒神经胶质细胞重编程的基因调控网络，研究人员开发了一种方法并且命名为整合调控网络分析（Integrated Regulatory Network Analysis, IReNA）。从斑马鱼、小鼠的群体、单细胞RNA测序的数据中整合获得10个差异表达基因的模块和米勒神经胶质细胞表的转录因子（图4.C和D）。同时，对ATAC测序的数据进行分析来确定不同的开放性印记，这些印记可以用来推断转录因子和差异表达基因的调控关系。构建了一个适用于斑马鱼和小鼠每一个模块的整合基因调控网络并且建立了一个模块内部的调控网络（图4.E和F）。在斑马鱼中，研究人员观察到静息的米勒神经胶质细胞中存在大量可能是自激活的活化模块，这些模块提升了其他静息模块的基因表达同时抑制了重激活相关模块的基因表达（图4.E）。这些重激活相关模块的转录因子包括ascl1a, tgif1和six3b，都是在斑马鱼米勒神经胶质细胞重编程过程中必须的。在重激活网络中的转录因子会激活它们自己的表达同时会抑制静息状态下相关基因的表达。重激活网络的下游存在第三个模块（模块7和10），这些模块参与调控与细胞周期相关的基因。主要包括已知的调控细胞周期起始的转录因子，例如myca和e2f3以及神经发生过程，例如olig2和foxn4（图4.E）。在斑马鱼中，一旦米勒神经胶质细胞转变成为再活化状态，将会引起细胞重新恢复静息或者获得神经发生和增殖的能力，并且完全转变为神经性的祖细胞（图4.G）。
在小鼠中，我们同样发现了三个相互作用的模块网络（图4.F）。和斑马鱼类似，第一个网络包括静息米勒神经胶质细胞中活化的转录因子（模块1和2，图4.F）。例如在小鼠米勒神经胶质细胞中抑制反应性胶质化的Lhx2和Notch信号通路中的基因Hes1。这个静息相关的网络被认为来抑制另一个重激活相关网络的基因表达（模块5，6，7，9和10）。反之，这些模块又会抑制静息相关的网络，从而实现一种类似于斑马鱼的双向调控的关系（图4.E和F）。重激活相关网络的转录因子包括NFKB信号通路中的Rela/b和Nfkb1/2，近期有研究表明这些基因能抑制鸡的米勒神经胶质细胞的重编程。另外还包括提高胶质细胞活化状态的转录因子（Stat3, Sox9）和Hippo信号通路的靶点Tead1。小鼠米勒神经胶质细胞重新恢复到静息状态是被第三个网络驱动的，该网络不存在于斑马鱼中（图4.E和F）。这个网络富集了在静息米勒神经胶质细胞中表达的基因，例如Nfib和Sox5，它们在损伤刺激后立即表达下调，但是在后面的阶段中则表现出上调的趋势（图4.D）。这些模块和那些维持米勒神经胶质细胞的静息状态以及修复静止状态的模块不同。这些结果说明，在小鼠中，静息稳态的静息、重激活和重修复三个中间态是由三个独立双向、自激活的转录调控网络来调节的（图4.G）。
图5. 斑马鱼和鸡调控米勒神经胶质细胞重编程的基因验证。（A至F）在斑马鱼中，光损伤处理后，吗啡啉调控的和维替泊芬处理的hmga1a and yap1的敲除会抑制斑马鱼米勒神经胶质细胞的增殖（A至C）和神经发生（D至F）。（G）DMSO和维替泊芬处理的米勒神经胶质细胞的轨迹分布。下图展示了在三种状态下DMSO和维替泊芬处理的米勒神经胶质细胞的比例。（H）米勒神经胶质细胞中维替泊芬诱导的基因表达。图中展示了表达细胞的比例。（I和J）利用BMS309403抑制FABP5/7/8会减少鸡中NMDA损伤处理后48小时祖细胞的形成。（K）NMDA损伤后48小时，对照组和BMS309403处理的鸡视网膜三种状态米勒神经胶质细胞的分布情况。SC，标准对照；ONL，外核层；INL，内核层；GCL，神经节细胞层。标尺为20μm。误差线为标准偏差。
6 调控米勒神经胶质细胞基因的验证
为了筛选进行功能分析的候选基因，研究对调控网络每个基因的关联度和在米勒神经胶质细胞中表达量的差异倍数进行了分析（图4.H）。随后对斑马鱼中预测调控再激活的转录因子是否是米勒神经胶质细胞重编程必须的进行了检测。在斑马鱼和小鼠中，非组蛋白HMG家族DNA连接蛋白基因hmga1a/Hmga1会在重激活的米勒神经胶质细胞中被诱导（图5.A和C）。随后还检测了在重激活状态下被诱导的基因yap1，该基因对于爪蟾和小鼠米勒神经胶质细胞退出静息状态是必须的。Yap1吗啡啉突变体显示米勒神经胶质细胞的增殖减少了（图5.B和C）。Smarca5—一个在重激活的米勒神经胶质细胞中表达的SWI/SNF相关染色质调节因子和增殖祖细胞中表达的myb，同时敲除的吗啡啉突变体会导致米勒神经胶质细胞的增殖减少。伴随着视杆细胞、红蓝视锥细胞肉眼可见的显著性减少，所有能降低米勒神经胶质细胞增殖的处理都会阻碍光受体的再生（图5.D至F）。另外，单细胞测序结果显示hmga1a吗啡啉突变体和维替泊芬处理的视网膜都表现出米勒神经胶质细胞的增殖减少，同时伴随着再激活米勒神经胶质细胞的增加（图5.G和H）。
本研究确定了在重激活的米勒神经胶质细胞中上调的进化上保守和物种特异的基因。例如，脂质体连接蛋白FABP5、FABP7和FABP8/PMP2（FBPs）选择性的在鸡的重激活的米勒神经胶质细胞中表达。利用BMS309403抑制FABPs会导致NMDA损伤后鸡的米勒神经胶质细胞增殖的减少（图5.I和J）。单细胞测序的分析结果显示，相比于单独用NMDA处理，BMS309403处理后会降低增殖中米勒神经胶质细胞的比例，同时伴随静息米勒神经胶质细胞比例的增加（图5.K），这些结果说明FABPs能促进损伤引起的由静息到重编程状态的转变。
接下来，研究了那些预测可以通过靶向作用NFI如Nfia, Nfib和Nfix来促进胶质细胞沉默的小鼠转录因子。检测了它莫西芬喂养的GlastCreER;CAG-lsl-Sun1-GFP;Nfia/b/xlox/lox小鼠，该小鼠的米勒神经胶质细胞中的NFⅠ被选择性敲除。Nfia/b/x的敲除降低了富集在静息状态胶质细胞相关基因的表达，例如Glu1和Rlbp1，但是上调了细胞周期调控（Ccnd1和Ccnd3）和神经再生（Ascl1）相关的基因。相比于对照组，无论是否添加FGF2+胰岛素，Nfia/b/x敲除小鼠的米勒神经胶质细胞在损伤后其增殖明显增多，同时在损伤后的3天里可以观察到EdU+/GFP+细胞存在于核的内层和外层（图6.A）。一段时间后EdU+米勒神经胶质细胞会在核外层消失，暗示可能存在处于有丝分裂期米勒神经胶质细胞的动力间胞核移行。在处理以后的第14天，米勒胶质细胞衍生的细胞表达了光感受器/两级细胞的标志基因CRX以及无长突/神经节/星形细胞的标志基因HuC/D和NeuN（图6.B）。
利用单细胞测序技术对NMDA+FGF2+胰岛素处理21天的来自于Nfia/b/x敲除小鼠的米勒神经胶质细胞进行了分析。Nfia/b/x敲除小鼠的米勒神经胶质细胞产生了一些独特的细胞群，包括增殖的米勒神经胶质细胞、神经性米勒神经胶质细胞、双极细胞和无长突神经相似的细胞（图6.D）。Nfia/b/x敲除小鼠的米勒神经胶质细胞显著的上调了一些与重激活相关的基因，例如Manf。神经性米勒神经胶质细胞没有表达细胞周期调节因子。相反，增殖的Nfia/b/x敲除小鼠米勒神经胶质细胞没有表达神经性的标志基因。RNA速度分析表明神经性米勒神经胶质细胞会分化产生两级细胞和无长突神经细胞（图6.E）。这些米勒神经胶质细胞衍生的神经元表达了典型的成熟两级细胞和无长突神经细胞的标记基因，但是没有表达其他视网膜细胞类型的标记基因。通过免疫组化证实了在米勒神经胶质细胞衍生的双极细胞中确实表达了ON双极细胞的标志基因PCP2。还发现来源于米勒神经胶质细胞的8.5%的CRX+神经元和6.1%的HuC/D;NeuN+神经元和EdU共表达。这些结果表明来源于Nfia/b/x敲除小鼠的米勒神经胶质细胞的神经元确实是通过细胞分化产生的。天然的双极细胞和无长突神经细胞和来源于Nfia/b/x敲除的米勒神经胶质细胞的神经元具有类似的表达谱。维替泊芬参与的YAP的抑制会导致增殖和神经发生的减少。感染了AAV9-Flex-TdTomato质粒的细胞显示米勒神经胶质细胞来源的神经元拥有双极细胞和无长突神经类似的形态（图6.F）。对椎体双极细胞的标签蛋白促泌素进行免疫染色可以发现，米勒神经胶质细胞来源的双极细胞在损伤2个月后，将突起延伸至内丛状肌层（图6.G）。
讨论
文章揭示了三个物种的米勒神经胶质细胞在损伤后都会进行重激活的状态，其中，小鼠的米勒神经胶质细胞在恢复静息状态前会停止活动。然而，绝大多数斑马鱼和部分鸡的重激活的米勒神经胶质细胞会经跨过这个阶段从而成为祖细胞。斑马鱼中对重编程必需的基因，例如six3b，tgif1和lepb在重激活的米勒神经胶质细胞中都是表达上调的。阻止在重激活的米勒神经胶质细胞中上调的基因，例如斑马鱼中的hmga1a，smarca5和yap1，鸡的FABPs，可以组织增殖和神经发生的过程。Hmga1a和yap1功能的丧失会破坏重激活到祖细胞状态的转变，而FABP的抑制则会通过阻止由静息到重激活的转变来打断重编程的过程。某些基因包括yap1会调控脊髓中神经发生的能力说明这些机制广泛的调控中速神经系统的再生能力。
虽然活化的小鼠米勒神经胶质细胞会瞬时的表达细胞周期调控因子和神经因子，但它们仍然很快恢复到静息状态。这个过程主要由专门的基因调控网络参与调控的，包括在损伤后期上调的NFI因子，它可以恢复小鼠米勒神经胶质细胞由重激活状态到静息状态。敲除小鼠米勒神经胶质细胞的Nfia/b/x会导致增殖的发生并且形成米勒胶质细胞起源的内层视网膜的神经元，而这个过程是被YAP抑制的。因此NFI因子能维持米勒神经胶质细胞的静默状态，阻止与重激活状态相关的基因的表达以及抑制类似于视网膜发育的神经发生过程。虽然前人研究表明下调Notch信号通路足够斑马鱼米勒神经胶质细胞重编程的发生，并且MYT1L依赖的抑制非神经元基因对于神经元命运决定的直接的重编程是重要的，但是本研究强调在细胞重编程的背景下，抑制细胞类型特异的基因也是非常重要的。
近期，有研究报道下调RNA结合蛋白Ptbp1在成年小鼠视网膜中可以将米勒神经胶质细胞转化为视网膜神经节细胞。然而，本研究发现在斑马鱼和鸡的损伤后的重编程的米勒神经胶质细胞中Ptbp1的表达是相对恒定的。类似的，在小鼠对照组和Nfia/b/x敲除的米勒神经胶质细胞中也没有发现Ptbp1的表达发生明显的变化。这些结果并不支持Ptbp1的动态表达变化直接参与调控米勒神经胶质细胞的重编程的假设。
许多相互独立的机制强烈的抑制小鼠的神经活性，使得从实验上确定米勒神经胶质细胞重编程的调控因子非常具有挑战性。相反，孵化后小鸡保留下来的有限的神经活性有助于分析正负调控米勒神经胶质细胞重编程的候选调控因子，这个现象使得鸡成为分析视网膜再生的非常有吸引力的模型。
恒温动物中枢神经系统损伤后的再生能力非常有限甚至是缺乏，其部分原因是对再生能力的极大抑制。有假说认为，这可能反映了物种在再生能力和对寄生虫的抵抗力之间的进化权衡。保持激活状态可使中枢神经胶质细胞有效的限制感染的传播，相反，细胞的再生会加速感染的传播。促炎症信号会抑制米勒神经胶质细胞的重编程支持了这种说法，并且损伤引起的轴突再生的进化丧失通常与损伤引起的神经源性神经发生的丧失是同步的。
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