科研 | Redox. Biol: PRDX6基因敲除诱导HepG2肝癌细胞线粒体功能障碍并将细胞周期阻滞于G2/M期
编译：秋秋糖，编辑：Tracy、江舜尧。
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过氧化物氧化还蛋白6(PRDX6)与肿瘤进展和肿瘤转移密切相关。它对磷脂氢过氧化物的作用及其磷脂酶-A2活性在过氧化还蛋白家族中至关重要。PLA2的丢失可能会影响改变脂质信号通路的特定脂质的水平，而过氧化物酶活性的丧失可能会导致关键蛋白中关键敏感半胱氨酸残基的氧化还原变化。增殖细胞核抗原(PCNA)中特异性半胱氨酸的氧化可干扰细胞进入有丝分裂，GSH/Glutaredosin系统下调可能是导致这些氧化还原改变的原因。本研究印证了PRDX6是连接氧化还原、动态平衡和增殖的元件链中的重要一环，并发现了其在调节线粒体的生物发生和功能、控制新陈代谢和细胞增殖方面的重要作用。
论文ID
实验设计
实验结果
1. PRDX6(HepG2 PRDX6-/-)基因敲除HepG2细胞系的构建及鉴定
作者按照材料方法中描述的CRISPR-CAS9技术转染细胞，并计算效率，敲除效率为3.3%(图1B)。转染后的细胞在96孔板中进行有限稀释，每孔分离出一个克隆。将它们转移到24孔板上，然后用Westernblotting检测，只有一个PRDX6克隆被敲除，该克隆不与PRDX6的特异性抗体反应，但与抗肌动蛋白反应(图1C)。通过对敲除克隆的PRDX6基因进行测序，并将扩增出的413bp的特异区(图1A)与gRNA和Cas9孵育，均表明该突变是双等位基因，两个等位基因的修复方式不同。综上所述，得出的结论是，所构建的人PRDX6基因敲除的单克隆HepG2PRDX6-/-细胞系是双等位杂合的。
HepG2PRDX6-/-细胞的磷脂酶A2活性(IPLA2)明显低于HepG2PRDX6+/+细胞(图1D)。PRDX6过氧化物酶活性不能用现有的检测方法与粗提物中的其他过氧化物酶相区分，因此不能测定PRDX6过氧化物酶。PRDX6的LPCAT活性也没有检测到，但定量蛋白组学分析(见下文)显示了LPCAT1酶在PRDX6基因敲除细胞中高表达，而在正常的HepG2细胞中没有检测到，猜测可能是一种代偿反应机制。
图1.稳转HepG2PRDX6-/-细胞系的构建
A)外显子编码区为下划线的prdx6基因序列，红色为与prdx6基因互补的gRNA区，大写字母为引物序列。B)在第4条带上检测到3条带，分别对应于用这些引物扩增出的原始区域(413bp)和Cas9核酸酶酶切得到的2条带(330和80bp)。计算了获得敲除效率和概率。C)Western印迹分析PRDX6蛋白基因敲除克隆。D)将构建的HepG2PRDX6-/-细胞系与标准HepG2细胞系进行比较，测定标准方法中每毫克蛋白任意荧光单位的比活性(PRDX6特异性抑制剂MJ33)。
2. HepG2 PRDX6-/-和HepG2 PRDX6+/+细胞的差异定量蛋白组学分析
进行了定量蛋白组学分析，以了解在全基因组范围内敲除PRDX6的影响。共鉴定出2843个蛋白。用STRING进行的系统分析显示，细胞周期、核苷酸生物合成过程、脂质代谢过程和细胞死亡调节受到影响(图2A)。根据IPA分析，敲除PRDX6激活的主要典型途径是“染色体复制的细胞周期控制”，而“PI3K/AKT信号”和“AMPK信号”被失活(图2B)。IPA还预测了几个上游调控因子的激活，如ERBB2、E2F1和YAP1，而RB1、CDKN1A和HIF1a则被灭活(图2C)。值得注意的是，抗氧化系统方面没有出现代偿性反应：在过氧化物氧化还原蛋白家族中，Prdx1、Prdx2和Prdx4的水平没有变化，而线粒体成员Prdx3、Prdx5和过氧化物氧化还蛋白样2A(PXL2A/FAM213A/PAMM)的水平以及Grx1的水平都显著下降。
总之，这个系统分析揭示了PRDX6基因敲除对细胞周期进程和新陈代谢的强烈影响。
图2.差异蛋白组学分析的系统分析
分析了HepG2 PRDX6-/-与HepG2PRDX6+/+相比具有统计学意义的差异表达蛋白，A)用字符串算法进行“GO生物学过程”聚类，并用四个主要过程以灰色表示红、蓝、绿、黄等过程，以及B)用IPA进行典型途径的富集。只有那些高于显著激活阈值z-Score≥2和≤-2的通路被显示出来。C)预测中排名最靠前的上游调节因子；包括复合体、基团、激酶、磷酸酶、转录调节因子等。
3. PRDX6的缺失对氧化还原蛋白组有影响
过氧化物还蛋白发挥抗氧化细胞防御作用，当PRDX6被消除时，ROS增加，从而影响氧化还原稳态。DCFDA荧光分析测定的ROS水平在HepG2PRDX6-/-细胞中实际上更高(图3A)。为了检查对蛋白硫醇的影响，分析了氧化还原蛋白组。共检测到2158个半胱氨酸标记的多肽，其中1112个可以定量检测，它们的还原/氧化比率在PRDX6基因敲除后发生了显著的变化。在这些肽中，218个被氧化，36个被还原(图3B)。IPA和David系统对这组氧化还原修饰蛋白的分析揭示了对新陈代谢和信号通路的广泛影响。比较重要的5条KEGG途径是“碳代谢”、“糖酵解/糖异生”、“氨基酸的生物合成”、“代谢途径”、“脂肪酸降解”，即“糖代谢途径”、“糖酵解/糖异生作用途径”、“氨基酸生物合成途径”、“代谢途径”、“脂肪酸降解途径”。在预测的上游调控因子中，重叠分数最高的是与细胞周期调控相关的MYC、TP53、E2F1，参与氧化应激反应的NFE2L2(NRF2)，与UPR、脂质和碳水化合物稳态相关的XBP1、MLXIPL(ChREBP)和INSR(图3C)。
与PRDX6敲低产生的碳代谢酶的氧化还原变化相比，HK2-Cys368和PHGDH-Cys281等胞质蛋白的氧化还原变化相似，而CLIC1-Cys191和PCK2-Cys55/63等线粒体蛋白在PRDX6基因敲除细胞中氧化程度更高，鉴于Grx1与1-CysPRDXs的功能关系，Grx1广受关注。从整体蛋白组和Westernblot结果来看，在PRDX6基因敲除细胞中，Grx1下调(图3D)，其两个“额外的”半胱氨酸C79/C83被更多地氧化(图3E)，反过来，在siRNA-Grx1处理的HepG2细胞中，PRDX6的“额外”Cys91也被更多地氧化。PRDX6的C91易于谷胱甘肽基化，而Grx1的C79/C83可以形成一个二硫键，暗示着剧烈的结构重排，这可能是其潜在的调控位点。
增殖细胞核抗原(PCNA)和精氨酸N-甲基转移酶1(PRMT1)这两个参与细胞周期进程和调控的蛋白分别发生氧化和还原反应。
图3.HepG2 PRDX6-/-细胞系的ROS和Grx1水平及差异氧化还原蛋白组的系统分析
A)基础细胞和100μMH2O2处理细胞的ROS水平以DCFDA归一化细胞数归一化的任意荧光单位表示(n=4)。B)PrDX6基因敲除HepG2细胞中定量半胱氨酸还原/氧化比值变化的火山图；虚线表示显著性阈值。C)对氧化还原蛋白组的IPA系统分析显示，上游调节因子预计会受到其目标蛋白氧化还原变化的影响，按p值递增排序。D)Western印迹法检测Grx1水平(n=4)。定量蛋白组学分析(n=4)确定的折叠变化(Fc)显示在图的顶部。E)在PRDX6基因敲除细胞中Grx1的Cys79/Cys83的氧化还原变化；还原/氧化比率如图所示。统计学意义通过学生t检验进行评估，并用与p值成反比的星号表示(*≤0.001，**≤0.005，*≤0.05)。
4. PRDX6缺失导致线粒体功能障碍、内质网应激和代谢改变
有报道发现PRDX6与线粒体清除之间的联系，以及PRDX6缺失诱导的LC3B和p62积累增加。在PRDX6敲除后，HepG2细胞中SQSTM1-p62显著增加，提示线粒体的功能状态发生改变。活体细胞外流量分析(海马)显示，在缺乏PRDX6的HepG2细胞中，基础呼吸、最大呼吸以及呼吸容量储备减少了近50%(图4A和B)。参与复合物I和复合物II(图4C)组装和催化的电子传输链的几个关键组件的水平急剧下降，应该可以解释观察到的线粒体呼吸功能障碍，线粒体形态在HepG2PRDX6-/-细胞中有显著不同(图5)。
HepG2PRDX6-/-细胞胞外葡萄糖水平较高，胰岛素受体和关键糖酵解酶(HK2，PFK1，ALDOC)的水平较低(图4D)，而细胞外葡萄糖水平较高，胰岛素受体和关键糖酵解酶(HK2，PFK1，ALDOC)的水平较低(图4D)。证实了当siPRDX6处理细胞时，在没有PRDX6的情况下葡萄糖分解代谢率降低，而HepG2PRDX6-/-细胞的胞外乳酸水平较高(图4E)，丙酮酸脱氢酶复合体的几个组分的水平较低，这表明，尽管葡萄糖消耗较低，但在线粒体呼吸能力下降的情况下，糖酵解为乳酸是其主要的代谢命运。
电镜显示缺失PRDX6的HepG2细胞线粒体功能明显低于野生型，与正常HepG2细胞相比，它们具有稀疏的基质和较少的嵴(图5)。氧化应激条件下线粒体蛋白量控制系统的主要组成部分线粒体Lon蛋白酶(LONP1)水平降低可能导致错误折叠蛋白的积累，从而解释了这种现象。KO细胞的内质网应激增强，如扩张的ER池(图5)和HSPA5/Bip(未折叠蛋白反应(URP)的主要调节因子之一)的下调。
其他一些线粒体原型蛋白也被下调，包括丙酮酸和2-氧戊二酸脱氢酶复合物(DLAT、DLST、PDHX、OGDH)、琥珀酸脱氢酶(SDHB)、PEP羧激酶(PCK2)和丙酮酸羧化酶(PC)以及抗氧化酶PRDX3和PRDX5。
总之，通过不同的实验方法，包括海马，蛋白组学和电子显微镜获得的结果，证明了PRDX6在调节线粒体的生物发生和功能，以及在新陈代谢控制中的作用。
图4.HepG2 PRDX6-/-细胞系线粒体功能
A)按照“线粒体功能”方案进行细胞外流分析(“海马”)时的耗氧率(OCR)的代表性记录；WT和Prdx6 KO细胞之间的差异非常显著，尽管加入FCCP后OCR有所下降。B)计算的基础和最大呼吸频率、ATP产生速率和呼吸容量储备的直方图，按蛋白含量归一化(n=4)。C)定量蛋白组学分析显示，HepG2 PRDX6-/-下调的复合体I和II的线粒体蛋白组分。显示UniProt ID、蛋白名称、折叠变化和统计分数；“-inf”表示在正常HepG2细胞中检测到该蛋白，而在PRDX6基因敲除细胞中未检测到该蛋白。D)细胞外葡萄糖和E)乳酸浓度由细胞数归一化的标准方法测定(n=4)。(*p-Value≤0.0001；**p-Value≤0.005)。
5. 尽管缺乏PRDX6的HepG2细胞中ROS水平升高，但NRF2并不是完全激活的
在HepG2PRDX6-/-细胞中ROS水平升高，导致NRF2激活，从而诱导ARE启动子调控下的抗氧化防御。实验发现，NRF2激活的两个标记NQO1和GSTM3仅轻微上调，但蛋白组学分析显示，许多其他正调控标记的水平显著降低，而负调控标记的水平显著上升（表1）。如上所述，过氧化物氧化还蛋白家族的三个胞质成员没有变化，而两个线粒体成员和类过氧化物氧化还蛋白2A显著减少。这些数据表明，在缺乏PRDX6的细胞中，NRF2的活性较低。在位于NQO1启动子的ARE中存在TPA反应元件(TRE)允许不同的转录因子竞争与这两个元件的结合，这解释了即使NRF2不完全具有活性，NQO1水平也会出现轻微上调的可能。
图5.HepG2 PRDX6+/+和HepG2PRDX6-/-细胞的电子显微镜照片
A)透射电子显微镜下的HepG2图像显示正常肝细胞细胞器；细胞核(N)、丰富的线粒体(M)、粗糙光滑的内质网(ER)突出显示。B)缺失PRDX6的HepG2细胞形态、细胞核形态及肝细胞器均发生改变，线粒体嵴减少，内质网池扩张。插图显示了每种类型细胞的放大选择，以显示线粒体的不同外观；标出了标尺。
表1 HepG2PRDX6≤/-细胞中NFR2靶蛋白的蛋白水平变化
6. PRDX6的缺失具有抗增殖作用，但不会诱导凋亡细胞死亡
与正常HepG2PDRX+/+细胞相比，基因敲除的HepG2PRDX6-/-细胞在接种后2、3和4天的增殖指数和细胞计数均显著低于正常HepG2PDRX+/+细胞(图6A和B)。细胞数量的减少不能用细胞死亡来解释，因为活力没有显着下降，电子显微镜(图5)或流式细胞仪(图7A和B)也并未观察到凋亡导致的细胞死亡增加的迹象。Westernblot以及蛋白组学检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和8的水平，未发生显著变化。此外，与之前在低PRDX6水平的HepG2细胞中观察到的一致，CD95蛋白水平显著降低(图6C)。这种受体传统上与细胞凋亡有关，但现在众所周知，它参与了其他多种非凋亡功能，刺激癌细胞中的CD95可以将这种死亡受体转化为肿瘤促进受体。
图6.HepG2 PRDX6-/-细胞系生长特性
A)细胞计数。B)增殖率。在4个不同的实验(n=4)中，在细胞培养24小时后进行检测。C)用Western印迹法检测对照细胞和基因敲除细胞中CD95的水平。统计学处理采用非配对学生t检验。
7. PRDX6缺失促进细胞周期阻滞于G2/M期
PRDX6基因敲除对细胞周期有明显的影响，因为一些细胞周期蛋白有不同的表达(表2)。细胞周期蛋白依赖性激酶4、细胞周期蛋白依赖性激酶1、细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1和增殖细胞核抗原在HepG2PRDX6−/-中表达增加，有利于细胞发生G1/S转变，这可能是氧化应激激活有丝分裂信号的结果。在缺乏PRDX6的细胞中，与MCM复合物、DNA复制和DNA修复相关的、参与G1/S进程的蛋白，如复制相关蛋白(MCM2-7)、小染色体维持复合物结合蛋白(MCMBP)、复制因子C(Rfc1-3)、DNA连接酶1(LIG1)和DNA错配修复蛋白2和6(Msh2和MSH6)也增加。在HepG2PRDX6−/-细胞中，胸苷酸合成酶(TYMS)和核糖核苷-二磷酸还原酶亚单位M2(RRM2)两个负责合成脱氧核糖核苷酸的酶也显著升高。在HepG2PRDX6/-细胞中，胸苷酸合成酶(TYMS)和核糖核苷-二磷酸还原酶亚单位M2(RRM2)也明显升高。此外，根据IPA(图2C)，E2F1-3上游调节因子似乎被激活，RB1失活，这与细胞周期进展超过G1/S一致。然而，在敲除细胞中，通过抑制CDK4/6而使细胞周期阻滞在G1/S的蛋白，如CDKN2A/p16，也增加了，尽管根据IPA的分析，CDKN1A和CDKN2A是不活跃的(图2C)。在PRDX6基因敲除细胞中，CDK2/Cyclin复合物抑制剂CDKN1B/p27kip1(CDKN1B/p27kip1)水平降低，而参与p27kip1多泛素化的细胞周期素依赖性激酶调节亚单位1(CSK1B)和S期激酶相关蛋白1(Skp1)水平升高。
在HepG2PRDX6−/-细胞中，G2/M转换和有丝分裂所必需的两种蛋白Centrin-2(CETN2)和TOP2A(拓扑异构酶2-α)也增加。关于p53，值得注意的是其抑制子cullin-5(CUL5)的低表达和其激活因子14-3-3σ(Sfn)在HepG2PRDX6−/-中的高表达。
除了细胞周期相关蛋白水平的这些重要变化外，作者还检测到其中一些蛋白有意义的氧化还原变化。其中，PCNA值得特别关注，其通过G1/S诱导细胞周期进程，并将细胞周期阻滞在G2/M期。在HepG2PRDX6−/-中诱导了它(表2)，Cys135和Cys162残基的还原/氧化比率下降了3倍(图8A)。这种氧化还原变化是否影响增殖细胞核抗原的活性还有待证实，但它们位于大多数增殖细胞核抗原相互作用蛋白结合位点附近蛋白区域的两个不同的β折叠片层中。实际上，它们在到目前为止解析的一些结构中形成了二硫键(图8B和C)。
这些蛋白组学数据表明PRDX6的缺乏影响了细胞周期，流式细胞仪分析结果发现，细胞被阻滞在G2/M期(图7A和B)。此外，通过DAPI(图7C)染色和透射电子显微镜(图5)观察到细胞核大小显著增大。
图7.肝癌细胞株HepG2(PRDX6-/-)的细胞周期参数
流式细胞仪分析显示在正常和PRDX6基因敲除的HepG2细胞中，细胞在不同的细胞周期中的分布和发生凋亡的细胞。A)记录一个代表性实验(紫色，凋亡细胞；绿色，G0/G1期；粉红色，S期；橙色，G2/M期)的荧光事件计数。B)细胞周期时相分布(n=4；多重t检验，**p值≤0.005)。C)如材料和方法第2.4节所述确定的核的大小(n>500；未配对的非参数Mann-Whitney检验；中位数和四分位数显示，*p值≤0.0001)。
讨论
作者通过CRISPR/Cas9技术，获得了稳定的PRDX6基因敲除单克隆肝癌细胞株HepG2。CRISPR-Cas9通过非同源末端连接(NHEJ)介导的基因破坏过程是由插入或缺失少数核苷酸组成的“插入片段”(Indels)引起的。这是一种细胞生存反应，能够与断裂的DNA链结合，其中“indels”不能是3的倍数，这样相应的基因就会产生一种不起作用的蛋白。在这种情况下，突变是双等位基因和杂合子，而且这两个等位基因的修复方式不同：一个等位基因缺失一个核苷酸，另一个等位基因缺失11个核苷酸。由于PRDX6的敲除，PLA2活性的丧失和ROS水平的增加得到了实验证实。
1. NRF2的作用
ROS水平的升高表明细胞对缺乏PRDX6的反应并不涉及预期的抗氧化防御机制的激活。抗氧化防御机制激活时，ROS氧化KEAP1中的氧化还原敏感型Cys致使NRF2从泛素化中解脱出来，并准备移动到细胞核以激活ARE启动子，以进行抗氧化防御。然而，情况似乎并非如此，这表明当PRDX6不存在或者NRF2被KEAP1非依赖机制下调时，氧化等价物没有到达KEAP1半胱氨酸。NRF2通过Cys514在细胞核中的氧化还原调节依赖于Trx，Cys514是一个关键的氧化还原敏感的Cys残基，在b-zip转录因子家族中保守，但在基因敲除细胞中，Trx系统的水平和氧化还原状态不受影响。然而，在PRDX6基因敲除细胞中观察到的GRX/GSH系统的显著降低可能影响NRF2核转位的氧化还原调节。S349磷酸化的p62/SQSTM1通过与KEAP1结合和失活来激活NRF2。虽然p62/SQSTM1在HepG2PRDX6 NRF2-/-细胞中被高度诱导，但这种激活机制在这些细胞中并不占优势，要么是因为p62没有磷酸化，要么是因为其他NRF2失活机制正在发挥作用。
NRF2也可以通过依赖于GSK-3β的机制，通过PI3K/Akt途径或ERBB2被灭活，抑制PI3K/Akt通路(图2B)将保持GSK-3β活性，并同时失活NRF2活性。同时，激活ERBB2(图2C)会磷酸化和激活GSK-3β，但诱导PPP2R1A将抵消该激活作用。
在肝硬化期间，HRD1可以通过下调UPR对NRF2产生负调节，从UPR到NRF2泛素化的途径需要具有活性的IRE1α，它通过与内质网伴侣HSPA5/Bip结合而保持在非活性单体状态。该伴侣蛋白在KO细胞中被明显抑制，可刺激HRD1与NRF2的结合和蛋白酶体的降解。最后，RXRα对NRF2活性也有抑制作用抑制，在PrDX6基因敲除细胞中观察到了这一结果。这些数据表明，PRDX6基因敲除细胞中NRF2依赖的抗氧化防御激活被KEAP1非依赖机制阻断。
2. PRDX6的脂质代谢和PLA2活性
在PRDX6基因敲除细胞中诱导了PRDX6脂肪生成的脂质代谢和PLA2活性，包括胆固醇的生物合成，以适应细胞分裂前合成新膜的需要。脂肪酰基辅酶A-6-去饱和酶(FADS2)和微粒体细胞色素b5是长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)和二十烷基类化合物生物合成的第一步酶，它们的显著诱导可能是细胞对缺乏PRDX6引起的花生四烯酸(AA)升高的一种代偿反应。二十烷类化合物生物合成的一个关键调控成分是从膜磷脂中释放的未酯化脂肪酸的水平。在正常HepG2细胞中，含磷脂的sn-2-arachidonate可由PRDX6PLA2酶的活性提供AA。PRDX6PLA2的早期鉴定显示，含有磷脂的AA具有很高的活性，前期在PRDX6下调的HepG2细胞中检测到1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-GPC水平升高。此外，还发现了AA和PRDX6通过激活NOX2或Src家族激酶(SFK)的促肿瘤功能之间的关系。
PRDX6在磷脂酰胆碱磷脂上的PLA2活性会刺激溶血磷脂酸(LPA)的产生，其过氧化物酶和PLA2活性的顺序作用也会释放一种羟基脂肪酸(HFA)。鉴于剖析PRDX6在细胞生理学中的作用机制以及AA、HFA和LPA作为脂因子的作用的重要性，有必要确定其PLA2活性在体内的底物特异性以解决这一问题。综上所述，在缺乏PRDX6依赖的PLA2活性的细胞中，脂素的释放会受到影响，正如在线粒体和内质网水平上观察到的那样，这将在影响细胞完整性的信号通路中产生后果。
3. 有丝分裂/自噬
有丝分裂/自噬现象使HepG2细胞呼吸复合体I亚基显著下调，呼吸能力减弱，线粒体形态学改变明显，p62表达明显上调，HSP5A/Bip表达下调，提示线粒体呼吸功能障碍和内质网应激对PRDX6基因敲除有影响。NRF2失活参与线粒体功能障碍，特别是线粒体的生物发生，并可能在HepG2细胞对缺乏PRDX6的线粒体反应中发挥作用。在PRDX6基因敲除细胞中，激活的E2F1也可能参与其中，因为它是一种转录因子，不仅是细胞周期调节因子，还发挥着激活脂肪生成和核苷酸合成的作用，而且会抑制线粒体的生物合成和氧化磷酸化。TOMM34是一种胞质辅助伴侣，在未折叠状态下保护线粒体蛋白前体，TOMM34的显著增加说明线粒体前体在胞浆中积累，这部分解释了在PRDX6KO细胞中观察到的线粒体蛋白水平普遍下降的原因。
众所周知，线粒体和内质网之间存在着复杂的联系，因此来自受损线粒体的信号可能已经刺激了内质网表面ROS的产生。HepG2细胞通过激活未折叠蛋白反应(UPR)和自噬来应对H2O2诱导的氧化应激以求生存，然而，在HepG2PRDX6-/-细胞中，尽管线粒体损伤和内质网应激，但由于HSP5A/BiP水平的降低，UPR没有被激活，流式细胞仪也没有发现凋亡，这是因为caspases没有被诱导。
氧化磷脂的存在，如多不饱和脂肪酸酰化，显著诱导的Δ6-去饱和酶(FADS2)和LPCAT，和缺陷的脂质过氧化物修复缺乏PRDX6，再加上高水平的ROS和失活的NRF2可能导致细胞发生铁死亡，尽管蛋白组学和显微镜数据没有提供额外的证据。
自噬小体的增加揭示了自噬的发生。HSP90AB1和CDC37显著升高也指示有丝分裂激活。通过这种方式，细胞将获得用于生物合成的原料，以补偿葡萄糖摄取的减少。自噬调节的典型机制涉及营养感应激酶mTOR和AMPK，但已经描述了自噬诱导的其他独立途径。由于AMPK信号在PRDX6基因敲除细胞中被抑制(图2B)，因此可以调用需要完整高尔基装置的不饱和脂肪酸或通过在PRDX6KO细胞中上调的p38/MAPK14诱导。
PRDX6通过胰岛素信号通路调节小鼠肌肉细胞的葡萄糖稳态和脂质代谢。我们的蛋白组学结果表明，HepG2PRDX6PK1/-细胞的胰岛素受体和磷酸化蛋白激酶1水平较低，该激酶在胰岛素信号转导中起着激活PKB/AKT1的中心作用。这是PRDX6参与人肝癌细胞代谢调控的证据。这些结果再加上葡萄糖摄取减少和糖酵解途径流动减少(关键的糖酵解酶减少)，导致这些细胞失去了肿瘤细胞特有的Warburg效应，这使得PRDX6成为抗癌药物的良好靶点。
4. 细胞周期
由于细胞周期阻滞在G2/M期，HepG2中PRDX6的缺失导致细胞数量减少和增殖减少。细胞周期进程是一个生物过程，由多个氧化还原依赖的信号转导通路调节，以确保正确的细胞分裂，其中ROS对细胞命运的影响在细胞周期中。因此，PRDX6的缺失影响细胞周期进程。研究观察到细胞周期G1和S期相关蛋白的变化，这些变化表明细胞周期在p27降解、p21失活和E2F1激活中起着中心作用，从而成功地完成了这两个阶段的进程。然而，以前的报道称，PRDX6的沉默通过一种依赖于PLA2活性的机制将细胞周期阻滞在G1/S期。因此，作者在G2/M期观察到的阻滞应与其过氧化物酶活性有关。据报道，在HeLa细胞中，由于过氧化导致的PRDX6过氧化活性丧失和H2O2诱导的G2/M期阻滞之间存在相关性。
PRDX6与细胞周期之间的联系可能发生在关键蛋白氧化还原变化的水平上，从结果来看，PCNA是一个可能的候选者。PCNA对于通过M/G1和G1/S转换的进程、执行S期以及S期和G2期检查点是必需的。在PRDX6基因敲除的HepG2细胞中，除了依赖ATR/Chk1的最后一个检查点外，PCNA似乎在所有需要的步骤中都起作用。在这一阶段，整个周期的进展需要PCNA在几种蛋白的帮助下从DNA中分离出来，随后它被降解。我们在PCNA的Cys135和Cys162中发现的氧化还原变化可以影响与DNA分离有关的蛋白相互作用，这将构成氧化还原状态与细胞周期之间的新联系。
已知有许多蛋白与增殖细胞核抗原相互作用以调节其活性以适应细胞的需要，其中之一是PRDX6。最近发现人PCNA基因的单点突变Ser228Ile(变异体dbSNP：rs369958038)可引起疾病。该突变位于大多数PCNA相互作用蛋白的结合位点附近，并导致其与FEN1、LIG1和ERCC5的相互作用显著降低。Cys135和Ser228定位在两条相邻的反平行β-Sheet中彼此前面。PCNA的主要调控机制之一是在Lys164的泛素化和SUMO化，也在Cys135、Cys162和Ser228附近(图8C)。人们很容易推测，C135-C162二硫键的形成可能会损害大量构象变化所需的灵活性，这些变化极大地改变了PCNA互作蛋白的结合位点。然而，PRDX6是否可能是PCNA需要与DNA分离的蛋白之一，无论是通过H2O2或NOX刺激，甚至是通过直接相互作用，都还有待证实，但这将构成细胞氧化还原状态和细胞周期之间的新联系。Cys135和Cys162在真菌和植物的PCNA中不存在，这表明它们可能是哺乳动物通过进化获得的，作为“氧化还原开关”，微调细胞氧化还原状态和细胞周期进展之间的联系。这是一个有趣的开始假设，值得进一步研究。由于NRF2活性低，Grx1和GCLC(表1和图3C)的下调将损害GSH/GRX系统的作用，从而允许这些关键的半胱氨酸残基的氧化。Grx1在许多细胞的细胞核中的存在表明Grx1可能在到目前为止假设的细胞周期调节氧化还原机制中发挥作用。PXL2A/Fam213A/PAMM蛋白(PXL2A/Fam213A/PAMM)是一种分泌到细胞外间隙的抗氧化剂，它的缺失是PRDX6KO细胞氧化环境增强的另一个因素。
综上所述，缺少PRDX6诱导的G2/M期阻滞可以通过关键蛋白关键半胱氨酸残基的氧化氧化还原改变而发生，这是氧化还原状态与细胞周期进程之间现有相互作用的一部分。氧化变化导致Cdc25c中Cys330和Cys377之间形成分子内二硫键，这对Cdc25c与14-3-3的结合是重要的。由NRF2基因中断诱导的这种二硫键的形成导致G2/M期阻滞，并被GSH逆转。同样，关键半胱氨酸残基的氧化导致p53活化和细胞周期停滞也是众所周知的。虽然我们没有在PRDX6基因敲除细胞中检测到Cdc25c和p53的氧化还原变化，但它的功能是不能被抛弃的。此外，本文提供的数据表明，一种迄今未知的额外氧化还原机制通过氧化PCNACys135和Cys162来调节细胞周期。