科研|Nature 子刊：慢性肾脏病进展相关的血清代谢物和5-甲氧基色氨酸的抗纤维化作用(国人佳作)
编译：Mendelssohn，编辑：谢衣、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
慢性肾脏病（CKD）引起肾功能的逐渐下降，直至终末期肾病而需要透析或者肾移植。早期CKD通常无明显症状，而发展至终末期才被发现。
论文ID
原名：Identification of serum metabolites associating with chronic kidney disease progression and anti-fibrotic effect of 5-methoxytryptopha
译名：鉴定慢性肾脏病进展相关的血清代谢物和5-甲氧基色氨酸的抗纤维化作用
期刊：Nature Communications
影响因子：12.35
发表时间：2019.04.01
通讯作者：赵英永
通讯作者单位：西北大学 生命科学科学院
实验设计
实验结果
1. 筛选生物标志物
图1: 筛选出5种代谢产物区别不同分期的CKD。
2.验证生物标志物
上面实验筛选出5种代谢物，接着则以三个研究来验证这5种代谢物是否可以外推到其他CKD患者。
2.1 观察性队列验证
图2：代谢物和临床指标的多元统计分析及外部验证。
2.2 前瞻性纵向队列验证
图3：通过纵向队列研究进一步验证了这五种代谢物。
2.3 经药物治疗的队列验证
纳入114名服用依那普利、激素或五苓散治疗的CKD2患者，检测这5种代谢物在接受不同治疗患者中的变化。
首先，依那普利组。依那普利治疗半年前后，eGFR无明显差异；蛋白尿明显缓解；除了Taurine（牛磺酸）之外，其他4种代谢物在接受依那普利治疗后均有明显恢复。ROC分析提示乙酰肉碱曲线下面积大，提示预测准确率最高，其次是5-MTP（图4）。
图4：经依那普利治疗前后对5种代谢物的验证。
第二，激素组。激素治疗后，蛋白尿明显下降；除了tiglylcarnitin（甲基巴豆酰肉碱），其他4种代谢物可明显恢复。ROC分析提示5-MTP、琥珀酸、乙酰肉碱的预测准确率比蛋白尿高（补充材料图3）。
补充材料图3：经激素治疗前后对5种代谢物的验证。
第三，五苓散组。五苓散治疗后，蛋白尿明显降低；除了tiglylcarnitin（甲基巴豆酰肉碱），其他4种代谢物可明显恢复。ROC分析提示5-MTP和乙酰肉碱的预测准确率高； 蛋白尿的预测准确率最高，可能说明早期CKD患者服用五苓散在降低蛋白尿方面比服用依那普利或激素获益更多（图5）。
图5：经五苓散治疗前后对5种代谢物的验证。
3.验证5-MTP的肾脏保护作用
研究者在前面的研究中纳入703名受试者，采集血清进行液相质谱分析，鉴定出25109种成分，筛选出5种代谢物，并通过三个队列研究来验证。文献检索发现：5-methoxytryptophan (5-MTP，5-甲氧基色氨酸是进展性CKD代谢物，且与eGFR相关；对血管损伤有保护作用；抗炎作用已有既往研究证明，但在肾脏方面仍需进一步探索。故，则开始验证5-MTP对肾脏的保护作用。
3.1 动物实验
首先，明确5-MTP的组织特异性。采用单侧输尿管梗阻小鼠模型，比较单侧输尿管梗阻小鼠与假手术组小鼠，检测心、肝、肺、脾、肾、前列腺、脑组织中的5-MTP含量。结果显示：在单侧输尿管梗阻的小鼠中，5-MTP在肾脏组织的下降比心、肝、肺、脾、前列腺和大脑的下降更明显（图6a）。
接着，验证5-MTP的抗炎、抗纤维化作用。使用单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型，分为假手术组、UUO组、UUO+5-MTP（10mg/kg）组、UUO+5-MTP（100mg/kg）组。HE染色和Masson染色评估小鼠肾脏的炎症和纤维化情况，结果显示：5-MTP可减轻UUO小鼠肾脏的炎症和纤维化（图6b）。Western-blot和免疫组化法检测炎症因子、细胞保护因子表达，结果显示：5-MTP的肾保护作用与NF-κB通路的抑制和Nrf2通路的活化有关（图6c-f）。免疫组化和Western-blot检测促纤维化标志物的表达情况，结果表明: 5-MTP可减少肾间质中fibronectin、vimentin、collagen I、α-SMA的表达，提高E-cadherin的表达，从而抗肾脏纤维化（图6g-i）。
图6：5-MTP的体内抗炎和抗纤维化作用。
3.2 细胞实验
使用TGF-β（转化生子因子-β）刺激诱导人肾小管上皮细胞损伤，分为①正常组、②5MTP-5umol组、③5MTP-10umol组、④TGF组、⑤TGF+ 5MTP-5umol组、⑥TGF+ 5MTP-10umol组。Western-blot检测炎症因子、抗炎因子的表达；免疫荧光检测NF-κB p65的表达；免疫组化检测促纤维化标志物的表达。结果提示：5MTP对TGF诱导的肾小管上皮细胞有抗炎、抗纤维化作用（图7a-c，g-i）。
使用LPS（脂多糖）刺激诱导人肾小球系膜细胞的损伤，分为①正常组、②5MTP-5umol组、③5MTP -10umol组、④LPS组、⑤LPS +5MTP-5umol组、⑥LPS +5MTP-10umol组。Western-blot检测炎症因子、抗炎因子的表达；免疫荧光检测COX-2、HO-1的表达。结果提示：5-MTP对LPS诱导损伤的肾小球系膜细胞有抗炎作用（图7d-f）。
图7：5-MTP的体外抗炎和抗纤维化作用。
4.验证TPH-1是肾脏保护的作用靶点
色氨酸作为人体一种必需氨基酸，色氨酸在色氨酸羟化酶（TPH-1）的作用下生成5-MTP。5-MTP则具有抗炎、抗纤维化的肾保护作用。所以研究者则提出TPH-1是否为肾脏保护的作用靶点。
4.1 细胞实验
第一，由TGF-β诱导损伤的人肾小管上皮细胞（HK-2）和由LPS诱导损伤的人肾系膜细胞细胞（HMC），比较正常细胞与刺激损伤后的HK-2和HMC的TPH-1表达差异。结果提示：肾脏细胞在刺激损伤后的TPH-1表达减少（图8a）。
第二，HK-2和HMC，分为三组：①正常HK-2和HMC；②Si RNA的HK-2和HMC；③TPH-1 SiRNA的HK-2和HMC，比较各组TPH-1的表达。结果提示：TPH-1沉默表达的肾脏细胞的TPH-1表达减少（图8b）。
第三， HK-2，分为三组：①正常HK-2；②TGF诱导损伤的HK-2；③TGF诱导损伤+TPH-1 SiRNA的HK-2。比较三种细胞的促纤维化标志物的表达差异。结果提示：TPH-1表达减少的肾小管上皮细胞，促纤维化标志物表达增多。
4.2 动物实验
第一，与正常小鼠相比，单侧输尿管梗阻小鼠和缺血再灌注小鼠中，TPH-1的表达显著下降。
第二，与TPH-1正常表达的单侧输尿管梗阻小鼠和缺血再灌注小鼠相比，TPH-1过表达的单侧输尿管梗阻模型、缺血再灌注模型小鼠中， 5-MTP明显上调；促纤维化标志物下调；促炎标志物下调。
第三，与TPH-1正常表达的单侧输尿管梗阻小鼠相比，TPH-1敲除的单侧输尿管梗阻模型小鼠，结果提示：促纤维化标志物上调；促炎标志物上调。
因此可知，TPH-1对肾脏保护作用起着关键作用！
图8：TPH-1在肾损伤中的保护作用。
讨论
综上所述，本研究发现5种代谢产物，可用于区分早期CKD患者与健康对照者，并作为早期肾脏疾病的准确生物标志物。这些生物标记物可以作为肾脏疾病现有生化指标的有益补充。在机制上，5-MTP及其调节酶TPH-1的缺失通过激活NF-κB和抑制nrf2通路而导致肾损伤。因此，靶向TPH-1可能成为CKD治疗的一个靶点。
评论
本研究的整个研究思路如下图，通过非靶代谢组学和靶向代谢组学结合（上下纵向）细胞和小鼠模型的分子生物学（左右横线）实验，筛选到5个CKD早期诊断标志物（5-甲氧基色氨酸、琥珀酸、乙酰肉碱、甲基巴豆酰肉碱和牛磺酸），并证明了5-MTP具有抗炎和抗纤维化作用，并进一步证明合成5-MTP的关键酶TPH-1对肾保护起关键作用，可能作为治疗CKD的潜在治疗靶点。
原文网址：https://www.nature.com/articles/s41467-019-09329-0