综述 | Curr Opin Chem Biol：基于活性和反应性的蛋白质组学:近些年的技术进展和在药物发现方面的应用
编译：Y.too，编辑：Emma、江舜尧。
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基于活性的蛋白谱学研究方法（ABPP）是一种功能强大的化学蛋白质组学技术，ABPP的核心是运用活性导向的探针分子在复杂生物样品中特异地标记靶标蛋白质。在过去的二十年里，ABPP在人类和传染病中促进了新药物靶点的鉴定和先导化合物的发现。此外，阐明药物蛋白质组学是全球持续努力的一部分，近年来，基于活性的探针可定位的目标类的清单已大大扩展。在这里，我们提供了ABPP的概述，并总结了主要的技术进步以及探针的发展。
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内容
最近的遗传学证据显示，有相当一部分未得到充分研究的蛋白质导致了人类疾病。尽管如此，生物医学研究人员通常只关注一组狭窄的特征很好的靶点，导致只有10%的人类蛋白质组可以通过抗体或化学工具进行药理调节。目前需要开发新的工具和技术，以支持新药物靶点的识别和新治疗策略的构想。
基于活性的蛋白谱学研究方法（ABPP）是一种化学蛋白质组学，监测复杂蛋白质中酶活性的技术，化学探针和定量蛋白质组学的联合应用。自20世纪90年代以来，ABPP已被成功地用于表征蛋白质功能，用于药物靶点和小分子抑制剂的发现。ABPP的核心是使用活性探针(ABPs)，是功能化的小分子，(1)一种用于特异性氨基酸与靶蛋白共价结合的亲电弹头；(2)调整ABP特异性和/或将弹头与标签之间的不良相互作用最小化的连接剂；(3)用于标记靶标的检测或纯化的荧光和/或亲和标签(图1a)。标记后，蛋白可通过SDS-PAGE分离的蛋白或通过亲和素富集生物素标记的蛋白的凝胶荧光扫描而展示，以便通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行下游识别(图1b)。对于MS分析，可以使用无标签定量或同位素标记对两个或多个样品中的酶活性进行定量评估。在后一种方法中，独特的同位素特征通常通过使用同位素分化生物素标签、串联质谱标签(TMTs)或细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)引入到蛋白质或肽段中。这通常被用于鉴别疾病模型中的异常酶活性或评估小分子抑制剂的靶向作用(图1c)。
图1 活性蛋白分析(ABPP)概述
在过去的二十年里，ABPs已经被开发用于描绘不同种类的酶的活性。这些探针定位于其靶蛋白活性位点内的保守残基，其特异性是由不同酶家族的机制差异所决定的。类特异性探针的早期例子包括用于标记丝氨酸水解酶活性位点的氟磷酸盐和用于类木瓜半胱氨酸蛋白酶的乙酰氧甲基酮探针。探针已经发展用于不同酶类的化学选择性谱，包括组织蛋白酶、legumains、半胱天冬酶、蛋白酶体蛋白酶、精氨酸甲基转移酶、激酶、酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶、糖苷酶和去泛素酶(DUBs)。总之，它们的应用为蛋白质在各种疾病中的功能提供了新的见解，揭示了新的生物学，促进了药物和药物靶点的识别。本综述旨在提供过去两年ABPP的最新技术进展。在这里，我们着重于开发新的酶类和氨基酸类型的探针，通过它们的应用，可能为药物发现提供新的见解。
1. 类特异性探针
最近在类特异性分析方面的进展集中在用ABPs扩大酶的靶标库。这包括介导翻译后修饰(PTMs)的添加(“writers”)和删除(“erasers”)的蛋白质，它们的失调与多种人类疾病的发病有关。例如，Nemmara等人开发了一系列苯并马唑-炔探针，用于选择性标记细胞内的蛋白精氨酸脱氨酶，精氨酸脱氨酶催化蛋白瓜氨酸化，并与一系列恶性癌症和自身免疫性疾病(如类风湿关节炎和阿尔茨海默氏症)有关。此外，ABPs已经开发用于泛素(Ub)蛋白降解系统的各个组分(E1, E2, E3酶和DUBs)，它们的异常活动可能导致神经退行性变、发育障碍或癌症。通常，这些探针具有一个或多个完整的Ub片段，作为Ub结合和去结合的共同识别元件，和/或C端亲电试剂，与各自目标活性位点内的催化半胱氨酸残基结合。最近的工作包括调整探针的特异性，使之适合于酶的不同亚类。例如，E2-Ub缀合物已被设计成与非天然酸结合，用于RING和HECT家族E3连接酶的选择性标记。为了克服与大的Ub探针的细胞渗透性相关的问题，基于肽和小分子的ABPs被开发用于在活细胞中分析DUB活性。在最近的一项研究中，Nattawadee等人[33]报道了泛素羧基端水解酶L1 (UCHL1)的第一个选择性氰基吡啶烷探针，在鉴定UCHL1依赖性肺纤维化的有效抑制剂方面的应用。此外，小分子ABPs也被用来确定两个公认的选择性USP14/UCH-37抑制剂，AP15和VLX1570 (I/II期临床试验候选)。在这里，使用炔标记类似物的竞争性ABPP实验显示，这些化合物与许多超出其报道靶点的额外蛋白质相互作用，导致大量蛋白质聚集物的形成和细胞死亡。在为这些抑制剂的细胞毒性化学类型提供分子解释的同时，这项研究强调了使用有效的化学工具探测DUB活性的重要性。
开发代谢酶作为探针也受到越来越多的关注。例如，Hoegl等人描述了吡哆醛类似物的发展，以描绘吡哆醛磷酸酯依赖酶(PLP-DEs)的活性，这些酶被广泛认为是传染病和人类疾病的重要药物靶点。这里，细菌病原体金黄色葡萄球菌中的PLP-DE活性的蛋白质组分析揭示了基于PLP的药物开发的几个潜在靶点，后来成功地用于筛选抗结核药物D-环丝氨酸的脱靶活性。然而，在原核细胞中使用吡哆醛模拟剂的一个固有限制是需要破坏原生PLP底物的生物合成，否则会与探针竞争PLP-DEs的活性位点。正如作者所强调的，这排除了在这些系统中完整的PLP-DEs蛋白组的覆盖，并可能错过重要的治疗靶点。最近，广谱ABP，STA-55，被报道用于醛基脱氢酶(ALDH)家族，在多种代谢途径中发挥作用，并与一系列代谢疾病相关，包括II型Ⅱ型高脯氨酸血症和Sjo¨greneLarson综合征。在这项研究中，作者应用STA-55在A549肺癌细胞中筛选已发表的ALDH抑制剂的选择性谱，强调了它们在验证针对这类酶的靶点作用方面的作用。这揭示了公认的ALDH抑制剂。
2. 广谱的反应性探针
亲核氨基酸促进蛋白质的多种生化功能，从酶催化到作为PTM的位点。此外，与氨基相关的亲核试剂结合的亲电基团正越来越多地与共价配体和药物结合，以增强它们的选择性、效力和/或药代动力学特性。例如，靶向非催化半胱氨酸在致癌激酶方面已作为一种提高酪氨酸激酶抑制剂的选择性的成功策略，且美国食品和药物管理局(FDA)批准了几种用于癌症治疗的共价药物。
最近临床中成功的共价抑制剂刺激了化学蛋白质组学技术的发展，以确定共价靶向的新的亲核位点。一个关键的进展是“基于反应性的分析”(RBP)，它通常基于同位素串联正交蛋白水解ABPP (isoTOPABPP)平台。isoTOPABPP和相关方法依赖于“广谱的反应性探针”，该探针具有亲电弹头，对特定氨基酸类型具有优先反应性(表1)。这些探针通常不具有上述任何结构元素(连接子、检测单元)，这增加了细胞的渗透性，并最小化了对探针-靶点结合能的任何可能的结构贡献，有效地消除了与弹头化学无关的任何“特异性”元素。对于isoTOP-ABPP，用两个浓度的炔基连接的广谱的反应性探针处理蛋白质组，然后，这两个独立标记的蛋白质被连接到生物素标签，结合，富集，酶解和LC-MS/MS分析。由于探针修饰的肽可以被直接检测到，因此既可以识别靶蛋白，也可以识别探针修饰的残基。该方法的基本原理是，通过比较两种处理方法之间的标记程度，可以对个别标记残留物的反应性进行量化;在高浓度和低浓度下，“超反应性”位点标记相同，而低反应性位点仅在探针处于饱和水平时才能识别。最初采用碘乙酰胺-炔(IA-炔)探针(表1)，对人类蛋白质组中半胱氨酸反应性进行排序，发现高反应性是半胱氨酸功能的预测因子。这确定了广谱RBP识别潜在的可给药性的功能位的一个关键应用。
经过最初的发展，isoTOP-ABPP已经被应用于内源性和外源性小分子的竞争性筛选。在探针标记之前，用半胱氨酸反应亲电试剂对蛋白质进行预处理，并通过相对于空白对照的标记减少来评估给定残留物上的配体结合。这使得我们能够识别出对氧化PTMs敏感的半胱氨酸，以及那些天然产物和fda批准的抑制剂所靶向的半胱氨酸。此外，竞争性isoTOP-ABPP已被应用于半胱氨酸活性共价片段的全蛋白筛选，促进了传统位点导向配体发现中可作为靶点的活性位点的识别。
为了进一步研究蛋白质与共价抑制剂的靶向性，研究人员已经将这项技术扩展到其他氨基酸类型。迄今为止，炔烃探针已被开发用于蛋氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸的化学选择性谱分析(表1)，它们共同促进了多种疾病中新靶点的识别。例如，Hacker等人开发了赖氨酸定向的四氟磺基探针(STP-炔；表1)对三种癌细胞蛋白质组的胺反应片段进行竞争性筛选。这些研究显示，在被认为“不可给药”和/或缺乏小分子探针的蛋白质中，有几种超反应的和可配体的赖氨酸。此外，配体结合通过破坏活性位点、变构位点和蛋白-蛋白相互作用位点来抑制几种代谢酶的活性。最近，硫三唑交换(SuTEx)化学被引入以促进酚反应探针的发展，用于反应性酪氨酸的功能分析。最初应用于通过抑制酪氨酸磷酸酶活性来监测癌细胞中磷酸酪氨酸位点的激活，硫三唑交换平台随后被用于片段配体的开发。在这里，对酚反应性1,2,4-磺酰三唑的竞争性筛选发现了几个影响酶活性的致癌基因中的配体位点。这项工作强调了酪氨酸残基在卵巢癌和鳞状细胞肺癌中是可行的治疗靶点，为了支持快速增长的ABPP方法的应用，Bach等最近开发了一系列光活化2,5-取代四唑，用于天冬氨酸和谷氨酸的位点特异性标记(表1)。本研究应用于细菌病原体金黄色葡萄球菌的羧基酰化配体的竞争性筛选，强调了酰氯是有前途的亲电试剂，能靶向这些氨基酸的共价抑制剂。
RBP未来的发展可能会涉及到在氨基酸方面的应用，而不仅仅局限于本文所强调的那些。例如，虽然尚未在蛋白质组水平上应用，但已经开发了用于重组蛋白中组氨酸和色氨酸残基位点特异性标记的化学方法。然而，在中心蛋白组学中，对细胞位点的识别和准确定量仍然是一个主要的挑战，例如，基于MS1的定量(例如在细胞培养中用氨基酸标记稳定同位素)通常使用复杂的定制数据分析管道(例如CIMAGE)来执行，这在非专业实验室可能不容易实现。此外，这些常用的方法在其多路复用能力方面受到限制，通常在单个MS运行中只能分析两个样本。最近将等压标记(例如TMT)整合到ABPP工作流程中，使得并行分析10个样本成为可能，并可能增加多肽/蛋白定量的可能性。然而，这些MS2标记方法需要先进的三级MS(MS3)方法去除“比率压缩”，这是一种现象，在这种现象中，涂层多肽扭曲了样品间TMT报告离子丰度的差异。
表1 已知的反应性探针及其蛋白质组学应用
3. 光激活荧光探针
ABP技术的最新进展是光激活探针的发展，可分为两大类：光反应性探针和光敏探针。如图1a所示，ABPP的典型工作流程依赖于ABP与目标蛋白的共价结合。这限制了该技术的应用，目标类共价结合机制在化学应用中是可行的，然而，对可逆的、非共价的小分子的分析是经常需要的。光反应性探针包含了额外的一部分，在紫外线(UV)照射下形成高反应性的自由基。然后，这个自由基驱动探针和可逆结合蛋白之间形成共价键(图2a)。自由基的反应性和不稳定性通常有助于确保只有探针的直接目标被共价修饰，常见的光反应性基团包括二苯甲酮、二嗪和芳基叠氮化物(图2a)。最近，这些基因被成功地整合到ABPs中，以帮助识别疟疾寄生虫恶性疟原虫中二氨基喹唑啉类和截断的肌球蛋白A肽的靶点，以及大麻素受体抑制剂和聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的作用。
ABPP鉴定的潜在靶点的优先顺序是该领域面临的基本挑战之一。尽管努力增强特异性，但反应性的亲电试剂总是与多种蛋白质结合。除了有助于分析不能被共价小分子靶向的蛋白质外，在最近的一项研究中，光反应性探针被用于研究蛋白质靶点的立体选择性，以及如何将其用于帮助靶点优先化。合成了八对ABPs，所有的ABPs都与光反应的重氮基基团结合，并且只在绝对立体化学上有所不同，并在细胞分析中进行了筛选。超过150个被识别的蛋白质表现出立体特异性的相互作用，对映体探针只有一个立体异构体与靶标结合。在几个对映体探针富集靶标的地方，只有一对探针显示立体特异的相互作用。所识别的蛋白质靶点跨越广泛的功能和结构类，其中一些是以前未识别的。已知的配体被证明可以抑制对映体探针的结合，证实探针的作用靶点。
对映体探针可用于确定目标的优先级，只有表现出立体选择性相互作用的探针可用于进一步的药物化学研究。这种新的ABPP技术不仅提高了药物蛋白质组学领域的知识，而且可能在未来的药物化学研究中用于开发高亲和力和适当选择性的抑制剂。但值得注意的是，本研究并没有排除立体特异性相互作用，可能是因为一个对映体中光反应性基团优先接近蛋白而导致结合亲和力增强。
光敏探针在探针的亲电弹头上加入了一个保护组，在特定波长的紫外光照射下，弹头会被切割。实际上，探针的反应性被掩盖，直到亲电试剂被释放，使探针的细胞浓度在标记和防止探针与膜硫醇和反应性脂质相互作用之前达到平衡。这增加了对靶点作用的空间和时间控制，可以限制在特定的细胞区域或治疗期间的特定时间点(图2b)。光敏策略依赖于验证过的保护组(图2b)，最近才应用于ABPP，目前仅用于分析半胱氨酸的反应性。在这项研究中，作者证明了碘乙酰胺探针的光敏化限制了广谱反应性和质量偏离靶点，提供了显著的好处，包括降低细胞毒性和降低背景读数。由于这项技术的实施仍有局限性，因此还不能排除制动组对探针蛋白结合亲和力和有效细胞分布的影响，这是潜在的缺陷。
图2 光反应性探针和光敏探针的机理
4. ABPP的未来发展方向
ABPs相关的酶类和氨基酸类近年来飞速增多。总的来说，这些探针在多种生物系统中的应用促进了各种疾病背景下新药物靶点和抑制剂的发现，这为下一代治疗学的合理设计奠定了坚实的基础。考虑到诸如抗菌素耐药性等持续存在的全球卫生挑战，仍然需要继续扩大药物蛋白质组并开发新的药物机制类别。未来的发展还可能包括扩展ABPP工作流程，以其他生物分子为目标，如核酸。通过将传统的富集方法与下一代测序相结合，有可能定量分析与临床DNA或RNA相关的反应位点，协助开发新的治疗策略。
在蛋白质片段相互作用的立体定向分析方面的最新进展，为优先选择配体位点作为预期靶点提供了强有力的手段。尽管取得了这些进展，下游研究确定靶点的选择仍然存在偏差，而且通常是基于相关蛋白的测定和/或功能信息。因此，具有潜在治疗价值的未鉴定靶点往往被忽视，此外，目前还没有方法可以权宜蛋白质组鉴定后酶、反应性氨基酸或配体氨基酸作为靶点的优先权。目前用于蛋白质和/或特定氨基酸残基功能特征的遗传方法包括时间互补和突变策略。因此，很明显需要开发能够实现反应位点功能优先化和充分实现ABPP卓越潜力的技术。随着基因组编辑技术的出现，如CRISPR/Cas9，蛋白质的功能特征和反应位点现在可能在系统水平上。因此，将这些技术与ABPP集成到用于目标优先化的系统“多组学”平台中，可能解决早期药物发现管道中的瓶颈，并促进药物蛋白质组的扩展。事实上，基于CRISPR的饱和突变筛选已经被开发来评估单个基因内和跨基因组的多个位点的氨基酸的功能，然而，据我们所知，这些方法还没有被应用在一种在ABPP实验中鉴定反应位点的残差特异性方式。