浅析耳鸣动物行为学模型的制作方法
耳鸣是一常见症状, 其发病机制至今仍不清楚 。长期以来 ,由于耳鸣动物模型的缺乏,对耳鸣的研究 多局限于人类, 大大限制了对耳鸣的深入研究。Jas- treboff 等在 1988 年用行为学方法, 证实了注射水 杨酸的大鼠确实感受到了耳鸣 , 从而建立了耳鸣动物模型 。但是,由于该方法操作复杂 ,设备条件要求 较高,故在具体实施时存在许多困难 。本实验通过, 改进方法 ,采用动物的“舔水时间” 代替“舔水率”作 为观察指标 ,同样能够证实动物感受到了耳鸣, 建立 了一种更为方便和切实可行的方法, 为耳鸣的研究 提供新的动物模型 。
一、 方法
1、动物分组
18 只大鼠随机分成 3 组 ,每组 6 只。第 1 、2 组为水杨酸钠组, 第 3 组为生理盐水对 照组 。
2、 给药及建立条件反射
将动物置于有持续 背景白噪声(72 dB SPL)的环境中 , 先适应性喂养 1 周,此期间只在晚七点开始从饮水器中给大鼠供水 (持续 1 h),恢复其夜间活动的习性并养成积极舔水 的习惯 ,为条件反射的建立创造条件。然后禁水 2 天,使动物处于干渴状态后,将动物移入隔声室内单 独训练以消除动物的随群性对其行为学的影响。实 验过程中室内温度 25 ℃, 室内灯光 12 h 开关, 以使 动物的昼夜节律保持不变。每只动物每天训练 30 min , 均在晚上相同时间段内进行。训练中条件刺激 (背景白噪声停止)分别于第 2 、5 、10 、15 、20 min 出 现,每次持续 1 min ,当背景噪声停止后 ,动物舔水超 过5 s 即给予电击(50 V , 从饮水嘴处给予), 次数不 定。水杨酸钠组 ,每天腹腔注射 10 %的水杨酸钠一 次,剂量为 350 mgkg ;生理盐水组 ,每天注射等量生 理盐水 。其中,第 1 组在条件反射训练前 3 小时注 射药物,直至实验结束;第 2 、3 组从条件反射消退期 (R ≤0 .2 后 , 不再给予电击即进入消退期)开始给 药,直至实验结束 。经 2 ～ 3 天强化训练后, 大鼠即 建立了“背景噪声停止 -舔水动作减少”的条件反 射。
3、 记录观察指标
在条件反射训练建立及消 退的过程中 ,用电脑计时器分别记录每只动物在背 景白噪声关闭前后各 1 min 内的舔水时间。将背景 噪声关闭前1 min 的舔水时间记录为A ,背景噪声关 闭后 1 min 的舔水时间记录为 B ,用舔水抑制率 R(R =BA +B)反映动物条件反射的建立及消退情况。
4、结果判断
当舔水抑制率 R ≤0 .2 时, 说明 动物建立了稳定的条件反射并视为消退期的起始 , 当R 等于或接近0 .5 时说明条件反射没有建立或已 完全消退, 记录各组从消退期开始至条件反射完全 消退的平均时间 。比较各组动物条件反射消退的快 慢以判断注射水杨酸钠后动物是否感受到耳鸣。
二、结果
前期的预实验表明, 动物在禁水2 天后,体重可 下降至原体重的 80 %,此时 ,动物处于干渴状态, 将其移至训练箱后, 在前 4 min 内的舔水动作稳定而 持久。实验表明, 在建立条件反射的开始阶段, 动物 因畏惧电击 ,出现长时间的躲避状态 ,以致在有背景 噪声时 ,也不去舔水, 此时 ,R 值基本在 0 .5 左右 ,说 明动物还没有建立条件反射。当反复训练后, R 值 逐渐下降 , 说明动物已逐渐意识到“有背景噪声存 在”时舔水是安全的。当 R 值稳定在 0 .2 或更小时, 说明动物已建立了条件反射 。
在条件反射消退期 ,各组动物舔水时间的恢复 情况见图 1 。其中, 第 1 组的平均消退时间为 5 .94 天 ,第 2 组的平均消退时间为 2 .75 天 , 第 3 组的平 均消退时间为4 .36 天 。经单因素方差分析, 各组间 差异均具有显著统计学意义(P <0 .05)。
三、讨论
基于饮水抑制的耳鸣动物行为学模型于 1988 年问世, 其理论基础是将部分剥夺饮水的动物置于 有持续背景噪声的环境中 ,并把背景噪声的停止与 电击相结合, 使动物把背景噪声的终止与危险联系 起来并主动抑制舔水, 从而建立“背景噪声停止 -舔 水动作减少”的条件反射。在引入耳鸣后 ,如果耳鸣 与背景声音相似, 动物在背景声音终止后应只感受 到很小的差异并会很容易忽略背景声音的终止, 即 使耳鸣与环境声音不完全一致, 仍与寂静迥然不同, 这样,动物对寂静环境的恐惧应消除的更快,即使动 物将耳内声音的有无作为安全与否的信号 ,并在行 为学上表现出来 。这一模型已得到广泛的承认, 然 而在这一方法中所使用的反映动物行为学变化的指 标“舔水率”即特定时间内舔水的次数可达 350 ～ 1 600 次甚至 6 000 ～ 8 000 次,因而操作起来非常困 难 ,如果没有特殊设备根本无法检测 。
近年来 ,国内外学者从不同的应用角度出发 ,对 这一方法进行了多种改进 ,包括用摄食次数作为行 为学指标的口服水杨酸钠溶液并结合食物奖励 法,使用录像设备记录动物在穿梭箱中来回穿梭 找水的次数作为行为学指标的给水奖励法 , 以及 用踏板取食的次数作为行为学指标的食物抑制法等,这些方法都是首先使动物建立与所选行为学指 标直接相关的条件反射, 然后记录背景噪声关闭前 后不同处理组动物行为学指标的变化来确定动物是 否感受到耳鸣, 但在操作上仍存在不完善之处 。
本实验以饮水抑制法为原理, 进行了以下三方 面的改进:
①用舔水时间代替舔水率作为行为学观 察指标 。在理论上 ,条件反射建立后的动物将耳内 声音的有无作为舔水是否安全的信号, 在行为学上 表现为有声音存在时舔水动作积极持续, 没有声音 时因恐惧电击而减少或停止舔水。在预实验中我们 发现, 处于干渴状态的大鼠在前 4 min 内的舔水动 作稳定而持久, 因此在背景噪声关闭前后的短时间 内(1 min)动物舔水所持续的时间能反映出对其对 环境的恐惧程度 ;同时,舔水率是特定时间内的舔水 次数, 而特定时间内舔水所需的时间与舔水次数正 相关 ,即舔水的次数越多所需的时间就越长, 因此舔 水时间的变化恰恰反映了动物舔水率的改变, 在实 际操作中 ,舔水时间较舔水次数更容易记录, 一边观 察一边记录就可完成 。
②进一步限定了背景噪声的 声学特点 。用信号发生器软件精确合成了频率为 10 kHz 的白噪声 ,并用精密声级计控制环境噪声强 度为 72 ±2 dB SPL , 使背景噪声尽可能与文献报 道[ 6] 的水杨酸钠导致的耳鸣的声学特点相一致。
③ 对动物的电刺激 ,文献报道均是从足底给予, 我们改 为从饮水嘴处给予 ,所使用的电压, 我们从 100 V[ 3] 降低到 50 V 。因在预实验中, 我们发现 , 动物在遭 到100 V 的电击后 ,对饮水长时间保持恐惧 ,致使在 有环境噪声时也不敢去舔水, 这大大延长了条件反 射建立所需的时间 , 而改用 50 V 的电击(从饮水嘴 处给予)后, 既可对动物产生明显电击效果, 使动物 快速建立起背景噪声与电击及饮水之间的联系 , 既 缩短了训练周期, 又增加了实验操作的安全性 。文 中结果显示 ,三组动物的条件反射消退时间差异有 显著统计学意义, 说明注射水杨酸钠后的 1 、2 组大鼠均感受到了耳鸣, 即耳鸣模型造模成功。
目前尚无耳鸣的客观诊断方法, 因此各种非特 异性因素(如灯光、水杨酸钠致动物听阈升高及痛阈 上升等)对动物条件反射的消退时间是否存在影响 尚有争议。其中 ,争论最多的是水杨酸所导致的大 鼠听阈上升是否对实验结果产生影响。在实验中 ,我们对注射水杨酸钠后 3 h 即进行条件反射训练时 的大鼠进行了 ABR 测试,发现其反应阈均升高了 20 ～ 30 dB nHL ,但是分别在条件反射建立前、后开始 注射水杨酸钠的 1 、2 组大鼠其条件反射的消退却截 然不同, 这说明水杨酸钠所导致的大鼠反应阈提高 对实验中大鼠行为学的改变不起主要作用 。因此这 只能用动物感受到了耳鸣来解释:在条件反射建立 前注射水杨酸钠的第 1 组动物, 在背景噪声停止后 感受到了耳鸣,而此时舔水将遭受电击,因此经多次 训练后第1 组大鼠将背景噪声停止后遭到的电击与 耳鸣联系了起来, 从而把耳鸣当成了危险信号并在 行为学上表现出来, 即在条件反射消退期当背景噪 声停止后虽不再有电击 , 但动物耳内仍有耳鸣这一 危险信号,以致条件反射消退的时间较其他两组长; 而从条件反射消退期开始注射水杨酸钠的第 2 组大 鼠 ,在背景噪声停止后虽然同样感受到了耳鸣, 但此 时处于条件反射消退期 ,舔水时不再有电击的出现, 同时由于耳鸣与背景噪声所具有的相似性 ,从而使 第 2 组大鼠将耳鸣当成了部分安全的信号 ,大大加 快了条件反射的消退。
以上的实验结果表明 ,按照经典的耳鸣动物模 型制作原理 ,在方法学上进行适当改进,同样能够达 到证明动物确实感受到耳鸣的结果。本实验所做的 这一改进,希望能够为耳鸣的研究,特别是药物对耳 鸣治疗效果的观察提供更为切实可行的研究手段。
原文摘录于《听力学及言语疾病杂志 2007 年第15 卷第1 期》。