非肿瘤疾病怎么和m6A扯上关系？
导语
今天和大家分享的是2020年3月份发表在Ann Transl Med杂志上的一篇文章(IF=3.297)“Contribution of m6A subtype classification on heterogeneity of sepsis”。文章中作者利用GEO数据库，鉴定出三种m6A亚型，经分析后它们具有明显不同的表观遗传学表现，免疫状态，生物学过程和结局，因此猜测脓毒症的异质性可能主要由m6A RNA甲基化引起。
Contribution of m6A subtype classification on heterogeneity of sepsis
m6A亚型分类识别脓毒症的异质性
一、研究背景
脓毒症是全身炎症宿主反应感染和器官功能障碍所引起的，在临床上具有高度异质性。通常治疗预后的失败被认为是由于脓毒症患者的异质性，因此不能在分子生物学水平上对脓毒症患者进行准确分类所造成的。先前的研究试图通过临床特征或生物标记物识别不同的亚型，但这些脓毒症分类研究尚未发现不同亚型的机制。由于m6A是参与整个生物过程（包括免疫，代谢，增殖和凋亡）调控的最常见的转录后RNA修饰，脓毒症中的异质性可能与m6A RNA调控有关。以前的研究已经证明了M6A调控与肿瘤的异质性。然而参与异质性脓毒症的m6A RNA调节因子的机制尚未解开。
二、研究思路
三、结果解读
1 数据集和患者的特征概况
图1.筛选数据集流程图
经过上图的搜索策略和筛选标准的选择，来自乌特勒支大学医学中心和阿姆斯特丹学术医学中心的一个mRNA数据集最终被纳入本研究。该数据集中共有479位患者均年龄超过18岁，并被诊断患有败血症。败血性休克率为34.8％，患者基本信息如下：
表1人口统计学和临床特征
2 系统综述收集的十二种m6A RNA甲基化调节因子
作者首先从公开发表的文献整理出十六个M6A RNA甲基化调控名单，然后将列表限定在GEO数据集中有可用RNA表达数据的基因，剩下十二个m6A RNA甲基化调节因子。这些m6A RNA调节因子包括m6A writers, m6A readers and m6A erasers，具体组成如表2。
表2. 12种m6A RNA甲基化调节因子
3 与脓毒症预后相关的m6A RNA甲基化调节因子
对12个m6A RNA甲基化调节因子进行单变量Cox回归分析发现，ALKBH5，HNRNPC，KIAA1429，WTAP和YTHDF2与28天累积死亡率显著相关（P <0.05）。ALKBH5和WTAP是危险比（HR）> 1的危险基因，而HNRNPC，KIAA1429和YTHDF2是HR <1的保护性基因。
图2.预后的m6A RNA甲基化调节因子
m6A RNA甲基化调节因子相关性结果：
图3.12个m6A RNA甲基化调节因子表达相关性
4 脓毒症中的m6A分子亚型
图4. k = 2–9的共识热图
从m6A RNA甲基化调节因子的表达相似性结果可见，k=2或3时比较合适，此时亚型稳定性从k=2增至队列中的9。
KM分析表明三种亚型之间28天的累积死亡率存在显着差异（P = 0.004）。但两种亚型之间的28天累积死亡率未显示出明显的统计学差异（P = 0.092），考虑到KM曲线和亚型稳定性，败血症患者最终分为三种亚型（亚型1，亚型2和亚型3）。
图5.五个m6A RNA甲基化调节因子的脓毒症预后亚型
在脓毒症队列中，亚型 3的患者有最佳的预后结局。在28天时，亚型 3的144人中有21人死亡（14.6％）（HR vs.所有其他亚型 5.42，95％CI : 0.359–0.819；P = 0.011），相比之下，224个亚型 1中的57人（25％）（HR 0.579，95％CI：0.364–0.920；P = 0.037）和112人中的36人（23％）亚型 2（HR 0.477，95％CI：0.272–0.833; P = 0.003）。
5 m6A亚型之间的免疫状态异质性
m6A每个亚型的调节图中显示不同的表达模式（P <0.05），在GSEA和CIBERSORT分析下，亚型之间免疫状态的有明显异质性。
图6.m6A调节子分布的异质性和亚型间宿主反应的差异
免疫状态的异质性包括免疫细胞中富集分数的显著差异和促炎性细胞因子表达的明显差异。在亚型 1（中度预后）中，与其他亚型相比，免疫增强细胞和促炎细胞因子显著上调，同时免疫抑制细胞也下调（P <0.05）。亚型 2（预后最差）中免疫细胞和促炎细胞因子的分布与亚型1中的分布完全相反（P <0.05）。亚型3（预后最好）中免疫细胞的富集得分和促炎细胞因子的表达处于亚型1和亚型2的中间。
6 亚型之间生物过程的异质性
图7.WGCNA中各种软阈值能力
通过WGCNA在脓毒症患者队列中确定出24个模块。亚型1与17模块（包括1,860个基因）正相关，相关系数为0.73，P值为8×10 -81。亚型2与1模块（包括3,423个基因）显着正相关，相关系数为0.68，P值为8×10 -70。亚型3与21模块（包括251个基因）显着正相关，相关系数为0.61，P值为8×10 -51。这些高度相关模块的基因定义为每种亚型的本征基因。
图8.WGCNA的24个共表达基因模块的层次聚类树
为进一步探索模块的生物学功能，进行了GO富集分析，结果如下图所示。十七模块（与亚型 1相关）的生物学功能主要参与在RNA加工和囊泡转运中富集。一模块（与亚型2相关）主要与核苷酸修复和细胞外基质有关。二十一模块（与亚型3相关）主要与自噬有关。
图9.亚型之间的生物学功能
共表达分析进一步确定了82个免疫分子和40个自噬相关分子可以通过预后的m6A RNA甲基化调节因子来调节，P <0.05且相关系数> 0.6。免疫分子和自噬相关分子分别来自免疫学数据库（https://www.immport.org/）和人自噬数据库（http://www.autophagy.lu/）。
图10.具有免疫和自噬相关基因的预后m6A RNA甲基化调节因子的共表达网络
四、小结
在本研究中，作者首先根据GEO数据集筛选脓毒症患者基因表达数据集，通过系统综述确定了12个m6A甲基化调节基因。利用共识k-means聚类方法在m6A预后分子的脓毒症中鉴定m6A三种不同的亚型，并评估了这些亚型与临床特征和生存结果的关联。随后通过基因集富集分析、加权基因共表达网络分析，GO分析和共表达分析，表明分型之间具有不同的RNA表观遗传学，免疫状态，生物学过程和结果，脓毒症的异质性可能主要由m6A RNA甲基化引起。
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