新概念：微晶病理学与结晶性病变
Review Ann Biol Clin (Paris) . 2020 Aug 1;78(4):349-362. doi: 10.1684/abc.2020.1557.
[Crystalline pathologies in the human body: first steps of pathogenesis]
（译文仅供内部学习使用）
人体的结晶病理：发病的第一步
在 60 岁以上的普通人群中，包括尿石症、胆结石、血管钙化和结晶性关节炎在内的结晶性病变的患病率非常高。通过物理化学技术在微米和纳米技术来表征组织中的微晶为医生破译这些生物实体的早期发病机制提供了新的机会。
这篇综述中，描述与直接从过饱和溶液或有机载体（如 DNA 或弹性蛋白）成核过程相关的各种化学过程。还将讨论在位于肾组织中的异位钙化的情况下起主要作用的囊泡，即 Randall 斑块。所有这些研究都集中在病理性钙化发生的第一步，这是开发能够避免在组织中形成这些异常沉积物的特定疗法的重要一步。正如已经强调的那样，晶体可能是各种病理的结果，但它们也与组织的功能障碍有关。
晶体病变非常常见，影响超过二分之一的 60 岁以上的成年人，无论是泌尿系统或胆道结石、血管钙化还是晶体关节病。通常被认为是良性的，这些病理有时会导致严重且非常致残的发病率。微晶病理学是目前全面展开的主要研究领域，这尤其是因为许多物理化学表征技术提供了机会，可以在亚细胞尺度上描述病理性钙化及其与周围组织的关系 [1 -3] .到目前为止，我们一直致力于通过实施实验室表征技术（如扫描场效应电子显微镜 [5]）或特定于大分子的表征技术来证明人体中异常沉积物的普遍存在性及其物理化学多样性 [4]。X射线吸收光谱仪等仪器[2]。这项研究使我们能够将肾脏中存在的病理性质与这些生物实体的物理化学特征之间的密切关系扩展到其他器官 [6-9]。
在本次更新中，我们将通过对近期文献的分析，讨论提出的病理性钙化发生的不同模型。从对均质和异质成核过程的定义的开始，我们将看到不同类型的化合物、晶体以及有机结构如 DNA 或弹性蛋白纤维都能够起到成核中心的作用。最后，我们将介绍两种影响转运蛋白功能的遗传疾病，即胱氨酸尿症和胱氨酸病。这些功能障碍导致在尿液中形成胱氨酸晶体。
均质和异质成核
成核（或萌发）的定义是晶种在过饱和介质中的自发形成，促进了分子聚集体的形成，分子聚集体将构成未来晶体的基石。因此，过饱和构成了“第一”过程，它决定了结晶动力学和所产生晶体的数量，从而决定了它们的演变和随后的性质，其中第一是尺寸。在由单一母相组成的高度过饱和介质中发生的成核称为初级，这导致结晶过程。
当成核发生在已经含有新相晶体的介质中时，它被定性为次生。然后为这些种子定义临界尺寸，从中引入结晶的概念。我们区分了在整个过饱和溶液（随机事件）体积中形成临界核的概率相同的均相成核过程和非均相成核过程，此时核在优先成核的位置上形成，特别是本身在介质中过饱和的另一种分子种类的晶种。
羟基磷灰石的均匀成核过程将允许引入第一个成核过程。X 射线衍射实验在将钙盐（通常是氯化钙或硝酸钙）制剂与含有磷酸盐的溶液相结合的水溶液上进行的 X 射线衍射实验显示，相对于以下离子对分布函数离子的最大值位于 1.55 和 4.1 Å埃之间，成对的离子 PO、OO 和 Ca-O、Ca-Ca，最后是 PP。该分析表明存在直径为 9.5 Å 的球形聚集体。它们的化学成分如下 Ca9 (PO4) 6, nH2O 。在这个聚集体的中心放置了三个位于三角轴上的 Ca2+ 离子。这些阳离子被由六个 PO43- 离子形成的第一层和由六个 Ca2+ 离子形成的第二层包围。在解决方案中，理论化学计算揭示了这些组件的稳定性 [11]。这些所谓的波斯纳簇被提及用于不同类型的结晶磷酸钙，例如羟基磷灰石、磷酸八钙、α 和 β 磷酸三钙 [12]。
这些基团构成种子，它们的逐渐组装与羟基磷灰石的结晶过程有关 [13]。请注意，根据分子动力学计算，这些聚集体似乎在几纳秒内在溶液中形成，它们的化学成分取决于储备溶液的成分 [11]。
事实上，波斯纳的模型经常受到质疑，尤其是在化学方面。当不是置于碱性环境而是置于酸性环境中时，就会出现这种情况 [14]。在这种情况下，观察到 Ca / P 比率在 1.18 和 1.5 之间 [14]。这些值反映了这样一个事实，即在酸性介质中，磷酸氢盐参与了矿物相的形成。这次基本单元将由[Ca2 + - (HPO4) 3] 4- 复合物组成，然后形成[Ca2 (HPO4) 3] 2- 实体。
最后，应解决生物溶液（如尿液）中其他阳离子的存在问题。这些，如 Na +，确实可以比钙更多地存在。分子动力学的第一次模拟表明，钠倾向于取代表层中的钙 [11]。正在研究在更复杂的环境中解决波斯纳团簇的化学问题，其中其他离子如 K +、Mg2 +、Cl-、HCO3- ...
在肾脏病学中，微晶（其组装会导致肾结石）在溶液中形成 [6]。在研究结晶时，与这些微晶相关的化学相是根据它们的形态、双折射和溶液的 pH 值确定的 [15]。与过饱和过程相关的方程式必须考虑抑制结晶萌发-生长过程的化合物的存在，并特别允许临床医生评估患者的复发风险。
在分析结晶尿时，在尿液中也会观察到重叠的结晶。就这些叠加根据特权晶体取向发生而言，提及与这些晶体相关的不同化学相之间的外延过程是适当的。因此，这些叠加往往表明尿液中也存在异质成核过程，并且在通过光学显微镜进行结晶尿研究时可以观察到（图 1）。在结晶尿分析过程中确定的化学相组合中，我们保留了以下组合：
无水尿酸微晶上的一水草酸钙微晶（图 1A）；
透钙磷石棒上二水草酸钙的八面体微晶，反之亦然（图 1B）；
无水尿酸微晶上的二水草酸钙微晶（图 1C）；
二水草酸钙 八面体微晶，方解石微晶附着在其各个顶点上（图 1D）。
这些关联应该被考虑在内，因为微晶的存在，以及它们的特征、丰度和重复样本评估的频率，提供了有关代谢因素或导致它们的病理的信息。其他关联当然是可能的。为了理解这些关联，有必要提高我们对这些外延过程中涉及的晶面的了解 [16]。
图1 以优选的晶体学取向附生发生的尿晶体的叠加：A. 无水尿酸微晶上的一水草酸钙微晶。B. 透钙磷石棒上二水草酸钙的八面体微晶，反之亦然。C. 无水尿酸微晶上的二水草酸钙 微晶。D. 八面体二水草酸钙微晶，方解石微晶附着在其各个顶点上。
使用扫描场效应电子显微镜 (SEM-EF) 对草酸钙结石进行观察，其中 Randall 板由一水尿酸钠和碳磷灰石的混合物组成，揭示了化学相之间的其他强相互作用 [17]（图 2A） .因此，SEM 图像与电子诱导 X 射线荧光光谱的分析相结合，揭示了由磷酸钙组成的圆形末端终止的尿酸钠的存在（图 2B）[17]。
图2 A. 在Randall 斑上一水草酸钙与尿酸钠结石。B. 尿酸钠终止于由磷酸钙组成的圆形末端 C. EDX 光谱显示在尿酸钠棒的圆形末端存在钙和磷。
图 3C 显示了兰德尔斑和一水草酸钙晶体之间的界面。肾结石的构建最初是通过由具有磷灰石结构的磷酸钙和覆盖该乳头表面的蛋白质通过捕获一水草酸钙晶体来进行的。逐渐地，微米大小的微晶聚集在一起，这一次形成了肾结石。这种岩石形成模式可以通过结石的形态分析（图 4）来怀疑，显示在对结石的显微镜检查中存在 Randall 斑碎片，构成了形态分析的第一步。以及通过实验室提供的结果的临床解释 [19, 20]。
图 3 A . 显示集合管出口的健康肾乳头。B. 在该乳头表面存在由磷灰石结构的磷酸钙和蛋白质组成的层。C. 一水草酸钙与兰德尔斑之间的界面，显示了在由碳酸磷灰石和蛋白质混合物组成的斑块中随机插入的一水草酸钙晶体。
图 4 在磷钙 Randall 斑上开始的草酸钙示例（箭头）。斑块位于对应于肾乳头印记的凹陷处。
相类似的过程，会影响心血管系统，特别是在心脏瓣膜的水平。对人心脏瓣膜结合组织钙化的病理学、免疫组织化学和物理化学表征技术（SEM-EDX 和傅里叶变换红外光谱 (IR-TF)）进行了研究 [21]。从大约十个样本收集的各种扫描电子显微镜图像显示心脏瓣膜表面存在异位钙化（图 5A、5B、5C）。由于这些沉积物的大小，这些沉积物无法通过医院使用的传统染色技术（例如 von Kossa）检测到。事实上，针的最小尺寸显然是纳米级的，而簇的尺寸是十微米级的。
这些被插入组织而不是简单地沉积在其表面上的针形物表现出两种非常不同的形态（图 5A、5B、5C）：管状（图 5A、5B）和“血小板形状”（图 5D） .这种差异表明可能有两个不同的化学相。此外，如图 5B 和 5C 所示，这些针束在瓣膜表面上可能有很多。
所有的图像似乎都表明磷灰石球的沉积发生在这些针簇上，其化学成分仍有待确定，但可能包含部分胆固醇（图 5D），如红外光谱所示 - TF光谱。通过 TF-IR 光谱和电子诱导 X 射线荧光实验证实了纳米晶和无定形磷灰石型磷酸钙的存在。
图 5 心脏瓣膜表面异位钙化的存在表现出两种形态：A. 和 B. 呈针状，C. 呈细长血小板形式。D. 这些结构似乎有利于磷灰石球的沉积。
因此，钙化发病机制的第一步似乎与瓣膜表面的改变有关，这种改变是由这些针状和血小板簇的形成引起的。由磷灰石磷酸钙组成的钙化直到第二阶段才形成。这种发病机制模型显着改变了必须设计以对抗此类钙化积聚的策略。
最后，表面的改变作为引发钙化的过程不仅涉及组织，还涉及器械。在一项专门针对泌尿科使用的“JJ”探针的研究中，发现探针表面的标记会显着增加该器械的表面粗糙度，导致钙化的形成 [22]。
蛋白质的作用
生理性钙化的理解，骨组织给出了一个教科书式的案例[23]。关于矿物质和胶原蛋白之间的相互作用，最近通过固态核磁共振进行的研究表明，蛋白聚糖（蛋白质和糖胺聚糖的组合）构成了矿物质和胶原蛋白之间的界面 [24]。这些糖还可以在矿物表面存在的矿物无定形部分的稳定性中发挥作用 [25]。
当谈到磷灰石生长时，我们不能忘记在骨骼的生长、形成或矿化中起主要作用的非胶原蛋白。这些蛋白质含有许多磷残留物，可以与细菌或小晶体结合，从而阻止它们的生长。
在某些病理情况下，有机纤维能够起到成核中心的作用。一般而言，聚集、糖基化（碳水化合物与具有游离胺基的分子（如蛋白质）之间发生的非酶促反应）和氧化是蛋白质修饰的主要类型。在许多疾病如糖尿病、动脉粥样硬化或神经退行性疾病中均可见到类型 [26]。
内源性糖基化反应在体内自发发生。这是一种不可逆的累积反应。它本质上涉及葡萄糖，这是体内最常见的还原糖。对于蛋白质，各种氨基酸的胺功能参与肽键。因此，只有在 N 端位置的氨基酸或在侧位具有氨基功能的氨基酸（赖氨酸、精氨酸、组氨酸）是糖化的目标。
糖基化对蛋白质有什么影响？当蛋白质在组织结构中发挥重要作用时，如细胞外基质蛋白质，它们的分子老化是相关组织机械性能逐渐丧失的原因。结果，胶原蛋白在糖化作用下变得更加坚硬 [27]，这也降低了弹性蛋白的弹性 [28]。
糖化和钙化有什么关系？一些研究倾向于显示糖化产物与钙化的存在之间存在密切关系。糖化最终会导致表型发生变化，将血管平滑肌细胞转化为成骨细胞 [29]。
在化学上，应该注意多糖能够作为磷灰石的成核中心并调节磷灰石微晶的大小和形态 [30]。事实上，多糖的官能团（例如-COOH、-OSO3H、-NH2、-OH）能够螯合二价Ca2+阳离子并与基团（PO4）3-和水分子形成氢键。在矿物表面[30]。更准确地说，成核速率和生长速率取决于官能团，顺序如下--COOH>--CONH2>--OH [28]。
在属于不同医学专业的工作中，扫描场效应电子显微镜使我们能够看到组织中存在的磷灰石球和纤维。图 6A 显示了这种钙化，由磷灰石结构的磷酸钙组成，附着在乳房组织中存在的纤维上 [7]。在皮肤结节病中，除了磷酸钙沉积外，还观察到由碳酸钙组成的钙化点（图 6）附着在皮肤中的纤维上 [31]。
图 6 A. 磷灰石结构的磷酸钙球附着在乳房组织的纤维上 [7]。B. 附着在结节病患者皮肤纤维上的碳酸钙球 [31]。
其他有机纤维也能起到成核中心的作用。细胞在裂解过程中释放的 DNA 就是这种情况 [32]。图 7A 和 7B 显示了 DAPI 染色证明的 DNA 共定位和“von Kossa”染色证明的钙化。
在动脉硬化中（图 7C 和 7D），“von Kossa”染色清楚地表明钙化跟随动脉壁中的纤维 [33]。在钙化防御的情况下（图 7E 和 7F），钙化的位置可能完全不同，因为它位于血管腔内 [33]。这种钙化位置的区别让人想起在肾活检中观察到的异位钙化 [34]。图 7G 和 7H 说明了由存在于管腔或管腔中的草酸钙组成的异位钙化
因此，即使这里的化学相不同（肾近端或远端管的草酸钙和血管的磷酸钙），定位的相似性似乎也存在。根据在心血管系统中进行的工作 [35]，可以区分两种类型的动脉钙化：
图 7 病理性钙化的不同组织表现 动脉硬化：DAPI 染色的 DNA 共定位 (A) 和茜素红染色的钙化 (B)。C. "von Kossa" 染色钙化似乎跟随血管壁的弹性蛋白纤维。D. 扫描电子显微镜下看到的钙化小动脉壁图像。钙化防御：E.“von Kossa”彩色钙化点位于血管腔内，F. 这些钙化点的扫描电子显微镜图像。高草酸尿症：G. 和 H. 在肾活检中发现草酸钙晶体，存在于肾小管细胞 (G) 或管腔 (H) 中。
内膜钙化（动脉粥样硬化）;内侧钙化 - 称为 Mönckeberg 硬化症 - 与血管僵硬有关。
虽然血管与近端和远端肾管之间存在显着的结构差异，但可以看出，在这两种情况下，流体和血管之间的界面都是由细胞提供的。
关于弹性蛋白上存在的钙化，已经做了很多工作。一些提醒是事先安排好的。弹性蛋白是一种完全不溶、疏水且耐用的聚合物，估计半衰期为 40 至 70 年。中央动脉内层的弹性随着年龄的增长而降低，这是由胶原纤维和/或糖基化逐渐取代弹性蛋白的过程 [36]。更具体地说，弹性蛋白/胶原蛋白比例是弹性的良好指标；该比率越高，血管弹性越大：它在主动脉弓水平等于 2，在腹主动脉水平等于 0.5 [37]。最后，应该记住，虽然弹性蛋白构成弹性纤维的主要成分 (90%)，但也存在其他蛋白质：微原纤维糖蛋白，如原纤维蛋白和与微原纤维相关的糖蛋白 [38]。
回到钙化，1950 年发表的一项研究表明，随着患者年龄的增长，弹性蛋白含量下降，而钙化增加。此外，这种钙化与弹性纤维的碎裂有关 [39]。最近基于转基因小鼠的研究表明，在动脉中，参与钙化过程的纤维确实是弹性蛋白纤维，而不是胶原蛋白 [40]。基于多种技术（X 射线衍射、IR-TF 光谱、拉曼）的研究，特别是钙阈值 X 射线吸收光谱似乎证实了这种发病机制 [41]。弹性蛋白纤维和钙化点之间的共定位的可视化是通过使用 von Kossa 和 van Gieson 进行双重染色来完成的，后者对弹性纤维进行染色而没有特异性。
囊泡中的晶体
无论是在生理条件还是病理条件下，体内的所有细胞都能够将囊泡释放到细胞外环境中。关于生理钙化，尤其是骨骼，第一个生长模型可以追溯到 1920-1930 年，并且基于囊泡的存在 [42]。关于这些生物实体的文献表明直径在 50 到 200 纳米之间 [43]。下面将讨论与这种钙化生长模式有关的某些要点。
首先，似乎骨钙素（一种在类骨质中发现的蛋白质）吸收细胞外 Ca2 + 离子 [44]。它们在基质囊泡内的运输可能是通过跨膜蛋白（如膜联蛋白）产生的通道进行的。然后成骨细胞产生富含碱性磷酸酶的基质囊泡，碱性磷酸酶诱导 Ca2 + 和 PO43- 的积累，以及能够从较大分子中释放 PO43- 离子的焦磷酸酶。胚芽-晶体转变导致基质囊泡降解，将它们排出到细胞外液中 [45]。
病理性钙化也受这种生长方式的影响。血管平滑肌细胞尤其如此[46]。由于钙化抑制剂的存在，这些囊泡在生理条件下不会矿化。否则，囊泡装载碱性磷酸酶，碱性磷酸酶通过降解焦磷酸盐诱导形成具有磷灰石结构的磷酸钙。因此，我们观察到一种类似于骨骼中存在的机制。
在其他病理环境中也观察到囊泡。图 8A 显示了一项针对动脉粥样硬化的研究中的这些囊泡 [47]。
肾组织中也存在囊泡 [46-48]。第一张透射电子显微镜图像来自 Khan 等人的工作 [48]。它们显示了肾组织中存在的囊泡（图 8B）。这些囊泡是 Randall 斑块形成的第一步，Randall 斑块是位于肾乳头顶部附近间质中的异位钙化点。然而，这些观察并没有给出存在于这些囊泡中心的沉积物的化学成分。这就是为什么我们进行了类似的观察，但将我们的观察与电子诱导的 X 射线荧光光谱的测量相结合（图 8C 至 8G），这是一种能够识别存在于这些囊泡中心的元素的技术 [49 , 50]。所有图像不仅显示了这些在肾组织中大小不同的囊泡，还显示了不同元素的空间分布，特别是这些元素中的磷（图 8E）、钙（图 8F）和氮（图 8G）囊泡。
图 8 A. 动脉粥样硬化研究中对囊泡的观察。B. 在一项针对 Randall 斑块的研究中对囊泡的观察（改编自 [48]）。C.-G。在一项研究中对囊泡进行观察，该研究致力于 Randall 斑块 [49] 和囊泡内磷 (E)、钙 (F) 和氮 (G) 的分布。
细胞内 VS 细胞外晶体
为了说明这两种情况，我们将使用胱氨酸晶体作为教科书案例。这种化学相伴随着两种性质截然不同的病理：
胱氨酸尿症，这是一种常染色体隐性遗传疾病，通过肾小管内和腔内胱氨酸结晶导致氨基酸尿症，导致结石病 [51]；胱氨酸病是另一种常染色体隐性遗传疾病，会导致代谢疾病，导致胱氨酸在溶酶体中积累，从而损害多个器官和组织，尤其是眼睛和肾脏 [52]。
胱氨酸尿症是最常见的遗传性病，其患病率约为 1 / 20,000。通过测试肾结石或进行结晶尿研究来做出诊断。胱氨酸是由两个半胱氨酸分子通过二硫键连接而成的氨基酸。存在于肾小管腔中的胱氨酸和二元氨基酸通过位于肾小管细胞腔侧的两个亚基 rBAT 和 B (0, +) AT 形成的转运蛋白被近端小管细胞吸收。B (0, +) AT 蛋白是转运蛋白，rBAT 调节其活性。一旦被细胞通过其腔内转运蛋白吸收，胱氨酸被水解成两个半胱氨酸分子，然后通过基底外侧膜被转运蛋白外化，加入血流。胱氨酸尿症是由二元氨基酸（胱氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸）的近端肾小管跨上皮转运蛋白缺陷引起的。不能再吸收鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸没有病理结果。相反，胱氨酸的积累，由于其在正常尿液 pH 值下的低溶解度，最终会导致尿液中的晶体形成胱氨酸结石（图 9A）（图 9B）。
图 9 A. 胱氨酸结石，Vb 型。B. 结晶尿：胱氨酸结晶。光盘。胱氨酸病患者的肾活检。C. 小晶体，孤立的或成簇的， D. 偏振光：白色晶体，伪矩形，折射。
胱氨酸病是一种罕见的遗传性代谢疾病，新生儿的患病率为 1/200 000 [52]。主要有三种临床症状：生长发育迟缓、多尿息肉综合征、6至12个月之间出现的维生素抵抗性佝偻病。通过白细胞内胱氨酸的生化分析，每毫克蛋白质显示高水平的半胱氨酸，通常> 3 nmole（正常<0.2 nmole) 和遗传研究。细胞内胱氨酸的测定实际上是基于对白细胞中胱氨酸和组织中的胱氨酸的测定[52]。
该疾病与身体大多数细胞中胱氨酸在溶酶体内的积累有关（图 9C 和 9D）。这是由于位于 17 号染色体短臂上的 CTNS 基因发生突变，该基因包含 12 个外显子，编码膜转运蛋白胱氨酸，将胱氨酸从溶酶体转运到细胞质中，在那里它被还原为半胱氨酸 [52] ]。
结论
本次能够讨论可能存在于体内的异常沉积物及其发病机制，这是研究病机的第一步。虽然简洁，但它使人们有可能了解这些生物实体的成核-生长过程的复杂性和多样性。事实上，描述了同质和异质成核过程，成核中心的作用可以由晶体（例如心脏瓣膜中的胆固醇晶体）或纤维（心血管系统中的弹性蛋白）发挥。最后，例如，由于这些钙化可以位于细胞内、生物体液中、内腔中或血管壁中或肾的近端或远端管的壁中，因此定位也可以具有非常多变的性质。
译者简介
吕建林教授的专著