科研 | Gut：细胞因子和微生物组在IBD患者妊娠期间的变化与调节
编译：陈佩佩，编辑：小菌菌、江舜尧。
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妊娠和IBD都与免疫学和肠道微生物组的改变有关。然而，在多大程度上IBD患者的免疫和微生物组受妊娠的影响尚不清楚。本文从46例IBD患者（31例克罗恩病（CD）和15例UC）和179例健康对照者中，分别于妊娠早期、中期和晚期，以及IBD患者产前和产后收集粪便和血清样本。用ELISA法检测外周血细胞因子，并对粪便微生物16S rRNA基因V4区进行序列分析。结果表明：妊娠期IBD患者孕前血清细胞因子水平明显下降。与健康对照组相比，妊娠期间白细胞介素IL-10和IL-5水平降低，IL -8和干扰素(IFN)γ水平升高，但细胞因子水平保持稳定。妊娠期IBD患者的微生物多样性较健康妇女降低，UC和CD在早期妊娠中差异显著。然而，这些微生物差异在中晚期妊娠期间不再存在。动态模型显示细胞因子和微生物组成之间存在着相当大的相互作用。妊娠期IBD患者血清促孕细胞因子水平明显提高，中晚期IBD患者肠道微生物多样性正常。因此，本文得出结论：妊娠对IBD患者是安全的，甚至有潜在的益处。
论文ID
原名：Modulation of cytokine patterns and microbiome during pregnancy in IBD
译名：细胞因子和微生物组在IBD患者妊娠期间的变化与调节
期刊：Gut
IF：17.943
发表时间：2019年6月5日
通讯作者：Petrus Peppelenbosch
作者单位：荷兰鹿特丹伊拉斯谟医学中心胃肠和肝脏学系
实验设计
结果
微生物组分析包括46名患者和179名对照组。而细胞因子水平对33例IBD患者和40例对照组的进行了分析。IBD患者与对照组的受孕时年龄相似，分娩方式相似。IBD孕妇使用更多的辅助生殖技术，而且往往是未产妇。IBD妇女在受孕时较年轻，体重指数（BMI）较高。妊娠期间的临床检查特征在妊娠过程中没有变化，CD的HBI和UC/IBD的SCCAI也没有显著差异。因此，该研究组可以对IBD患者和健康对照者的免疫状态和微生物群进行有意义的比较。
本文首先比较了16例IBD患者（12例CD患者和4例UC患者）在孕前和孕期血清中IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、TNFα和IFNγ的水平。PCA分析表明，CD和UC患者的总体细胞因子非常相似，在炎症期间采集的样本没有分别聚集（图1A）。在受孕期间，血清IL-6（T1-T3分别为p=0.005，p=0.027，p=0.012）、IL-8（T1为p=0.042，T3为p=0.012）、IL-12（T2为p=0.034）、IL-17（T2为p=0.0078）和TNFα（T2为p=0.039）水平显著下降。相比之下，IL-10从孕前到T1时升高，尽管不显著（图1B）。接下来，进一步探讨了在妊娠三个月期间，在更大的一组患者中IBD患者的细胞因子谱的调节（25 CD, 8 UC）。UC患者只有IL-12和IL-21，CD患者TNFα在不同孕期表现出适度的调节作用（图1C）。CD和UC患者之间的直接比较表明，CD患者的IL-9和TNFα水平较UC患者在第二和第三季度（p=0.0272和p=0.0201）较低（p=0.0361和p=0.0388）。怀孕期间药物使用的变化，最明显的是，在T3中抗肿瘤坏死因子的使用减少了，更多的患者在这个时间点完全不使用药物，5-氨基水杨酸（ASA）和硫嘌呤的使用没有随时间波动。主成分分析表明不同的治疗方法与细胞因子的整体改变无关。总体而言，聚类分析显示，样本分组更多地取决于患者个体，而不是疾病表现、是否存在肠道炎症以及从中获得样本或使用药物的妊娠三个月。因此，IBD患者的血清促炎细胞因子水平（以及整体免疫状态）在受孕时降低，在怀孕期间相对稳定。
研究了妊娠期IBD患者和健康对照组的血清细胞因子水平是否有差异。主成分分析表明，在健康者妊娠中，总体细胞因子不随时间变化（图2A），并且当与IBD患者和对照组比较时，总体细胞因子是相似的（图2B）。然而，对单个细胞因子的分析显示，健康孕妇血清中IL-6、IL-10和TNFα的水平在三个月内有显著变化（图2C）。最明显的是，在健康对照组中，IL-6和IL-10水平在妊娠晚期都表现出显著的上调。然而，这种上调在IBD孕妇中未见，IL-10水平在妊娠中晚期明显落后于健康对照组。此外，在整个妊娠期，IBD患者的IL-5水平显著降低。与对照组相比，IL-8和TNFα水平升高。IBD患者在整个妊娠期的IL-9水平只有整体差异。因此，健康妇女的妊娠与外周血细胞因子的特殊变化有关，而这些细胞因子在预期的IBD患者中似乎基本不存在。
随后分析了所有妊娠期IBD患者的微生物群。β多样性（样本间）分析未显示与不同时间点或抗生素使用有关的任何显著差异（图3A、B）。Faith’sPD和Pielou分别测量的丰富度（图3C）和均匀度（图3D）随时间的推移也没有显著差异。当观察相对丰度（图3E）时，硬壁菌有增加的趋势，放线菌和疣状芽胞菌数量有增加的趋势，但不明显。图4总结了CD患者和UC患者之间的差异。当对CD和UC患者进行分类时，测试结果的曲线下面积为0.75，表明微生物组反映了疾病类型（图4A）。细菌聚类显示CD和UC患者之间的细菌群落存在差异（图4B），更具体的分析显示两种疾病之间表现不同的几种细菌存在显著差异（图4C）。例如，Methanobacterium, Acidaminococcus 和 Akkermansia，YS2的一个未分类成员梭状芽胞菌纲的一级和一个未分类的成员，均与CD菌群呈正相关，与UC菌群呈负相关。Odoribacter和一个未分类的成员Peptoccaceae家族表现出相反的行为（图4C）。
接下来考虑CD患者的疾病位置是否也会影响微生物组成。UniFrac显示患有结肠疾病和非结肠疾病的患者之间的粪便微生物组存在显著差异（图5A）。此外，还发现了显著的特征差异。在专属性结肠疾病患者中，Bifidobacterium,Turicibacter, Clostridium, Oscillospira 和Diallster等特征非常丰富。在回肠或回肠结肠疾病患者中，Methanobrevibacter和 Ruminococcus的特征更为丰富（图5B）。使用Pielou均匀度图（p=0.02）和Shannon多样性指数（0.043），结肠疾病患者的样本α多样性较高（图5C，D）。CD患者的结肠疾病与UC患者不相似：将结肠和非结肠CD患者样本与UC样本进行比较时发现显著差异。当比较UC和CD患者在给定时间点的差异时，未加权和加权的UniFrac（图6A，B）在妊娠前样本（p=0.041）中观察到显著的β多样性差异，但在T1、T2或T3或妊娠后样本。基于LDA分数的LEfSe分析突出了每个时间点的显著特征（图6C-G）。在怀孕开始之前，UC患者有更高的Bifidobacterium adolescentis与CD患者相比，CD患者的Ruminococcus gnavus 和 Escherichia coli含量更高（图6C）。在早孕期，UC患者的Bacteroides caccae和Odoribacter的比例过高，而CD患者的Blautia obeum水平升高（图6D）。妊娠前CD患者的大肠杆菌水平在T2时再次升高。UC患者的放线菌属、厌氧菌属和细脉菌属含量较高（图6E）。在T3的这些孕妇中，Veillonella也明显较高，这与T3的CD微生物组相比，具有更高的丰度的Blautia，后者具有更高水平的F. prausnitzii和Ruminococcus bromii（图6F）。R. bromii与Bacteroides ovatus、链球菌和一种未分类的Lachnospiraceae成员（T3也较高）相比，R. bromii在产后妊娠期（CD患者）中的比例仍然过高，后者增加了UC患者的产后妊娠率（图6G）。聚类图（图6H）可以直观地显示两种IBD状态之间的差异以及在与妊娠相关的不同时间点观察到的差异
此外，还分别分析了妊娠期发作的CD和UC患者与未发作的CD和UC患者的微生物组群的差异。患有CD的孕妇在经历耀斑时，其细菌均匀度和丰富度（图7A）明显较高。LEfSe分析显示，有几个特征在女性身上表现过度。这些细菌包括Collinsella aerofaciens, Bacteroides ovatus, Dorea formicigenerans,Bilophila和 phylum Bacteroidetes（图7B）。LEfSe分析显示了不同治疗方法之间的多个不同特征（图7C）。有趣的是，在没有接受任何药物治疗的CD患者中，Coprococcus catus和 Ruminococcustorques的比例过高。还研究了体重指数的影响，没有观察到对多样性或多样性的任何影响。
IBD经产妇女与未经产妇女相比，未加权和加权UniFrac的β多样性差异显著（分别为p=0.027和p=0.045）（图8A、B）。此外，未产妇有较高的细菌丰度（图8C）。一些特征在未产妇样本中非常丰富，如Anaerostipes和Oscillospira。然而，在经产病人中，Bacteroides和Bilophila更为丰富（图8D）。有或没有生过孩子的IBD妇女的细胞因子类型没有差异。
IBD患者的微生物群在未加权（图9A）和加权UniFrac（图9B）方面都比健康对照组更相似（β多样性）。IBD患者的Faith's PD（图9C）和Pielou's测定的均匀度也较低（图9D）。还比较了每三个月的α多样性差异。与对照组相比，IBD患者T1期的细菌丰富度显著降低（图9E），这一点甚至可能被低估，因为IBD患者也更常是未产妇，并且这些患者的未产妇与较高的α多样性相关。这种影响在怀孕后期消失了。排除合并症并没有改变这些结果。
如图10所示，Sutterella是细菌网络的中心。这意味着多个特征的丰度与随后时间点的缝合线丰度增加正相关。细菌之间的负相关，例如，粪便细菌的丰度与第二时间点Sutterella丰度的减少相关。在模拟细胞因子水平和细菌数量之间的相互作用时，再次观察到正相关和负相关。总的来说，这些分析提供了大量数据，详细说明了微生物群、疾病类型、细胞因子谱和妊娠之间的关系。
图10 源节点的当前值与目标节点的值变化之间的相关性。绿色粗箭头呈正相关，红色细箭头呈负相关。一个灰色的细圆箭头表示一个特征的当前值和未来变化之间的相关性。细胞因子在红结节中有标记。
讨论
研究结果证实，在健康怀孕期间，细胞因子的模式从T1到T3的变化是存在的。然而，无法将妊娠期观察到的变化归因于Th2细胞因子（如IL-4、IL-5和IL-13）或通常与Th1反应相关的细胞因子（IFNγ 和TNFα）。根据本文数据，在怀孕期间改变Th2不太可能改善（自身）免疫疾病。然而，在目前的研究中，发现一些促炎细胞因子（IL-6、IL-8、IL-12、IL-17和TNFα）在IBD的病理生理过程中起作用，在受孕时显著下降，这表明妊娠降低了IBD患者炎症的免疫参数。本文还研究了怀孕对UC和CD微生物的影响，因为怀孕会影响微生物群。CD和UC患者在整个妊娠期内的微生物组群仍存在差异。然而，在妊娠前，UC和CD患者的β多样性不同，妊娠的开始导致β多样性的改变，从而导致微生物群的行为相似。一般来说，随着妊娠的进展，细菌特征的变化变得更加微妙（图6H），这表明妊娠对微生物差异的抑制作用。令我们惊讶的是，还注意到IBD微生物群彼此更相似（β多样性较低），这表明在大多数患者发病期间，同一物种正在消失。由于这两个队列来自不同的国家，而且DNA是用不同的方法分离出来的，无法确定这两个队列之间的不同细菌，而且之前已经证明，通过不同方法提取的样本仍然显示相同的多样性模式，但可能在特征水平上发生变化。
为了建立一个动态模型，检测了两个时间点间细胞因子或细菌对数水平的变化与初始时间内所有细胞因子和对数细菌表达值的相关性。虽然这些相关性并不是因果关系的明确证据，因为共同的因果关系会破坏因果关系，但它们提供了一阶动态模型。引起极大兴趣的是Sutterella，它与其他几种细菌的相关性增加。在小鼠中，Oscillospira与IFNγ呈负相关。Oscillospira是一种已知的丁酸产生菌，在炎症状态下呈下降趋势。Oscillospira与Actinomyces之间的相互作用也值得一提，因为第一种作用在IBD中被描述为减少，而第二种作用在IBD患者中被显示为增加。粪便细菌和Faecalibacterium的丰度与IBD的关系，但本文模型表明，粪便细菌的丰度与Faecalibacterium丰度的减少有关。
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