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导读
在高盐环境中，盐纳古菌被认为是一种独立生存的微生物。本研究报道了南极盐纳古菌的可培养情况，结果显示所涉及的盐纳古菌需要在Halorubrum lacusprofundi（一种Haloarchaeon）存在的条件下才能生长。通过富集培养成功富集到了Candidatus Nanohaloarchaeum antarcticus（Ca.Nha.antarcticus，一种盐纳古菌），然后结合流式细胞术（FACS）纯化得到该微生物，并验证了Ca.Nha.antarcticus对Halorubrum lacusprofundi 的生长依赖性，本研究所得出的结论满足科赫原则。本研究同时使用原位杂交技术和透射电镜展示了两者之间的相互作用现象。基于宏基因组测序分析了微生物群落组成，结合分箱技术从宏基因组数据中得到该菌的宏基因组组装基因组（MAG），进一步基于蛋白质组学研究代谢途径以及某些蛋白的结构和作用，揭示Ca.Nha.antarcticus和Halorubrum lacusprofundi之间的互作机制。总结来说，本研究扩展了古细菌共生生活方式的范围，并为进一步了解和控制微生物共生关系提供了一个遗传模型系统。
原名：Unexpected host dependency of Antarctic Nanohaloarchaeota
译名：Antarctic Nanohaloarchaeota 出人意料的宿主依赖性
期刊：PNAS
IF：9.58
发表时间：2019年7月
通信作者：Ricardo Cavicchiolia
通信作者单位：新南威尔士大学（澳大利亚悉尼）
本研究的研究对象为南极洲地区湖水样本（Rauer1湖和Club湖）。通过富集培养获得含有目标微生物较高丰度的样本（Nha-R1和Nha-Ce），相对丰度通过宏基因组测序数据得出。进一步地，富集样本中添加普伐他丁并接种带有抗性的Halorubrum lacusprofundi ACAM34-hmgA菌株来排除其他微生物的干扰并获得富集样本Nha-CFC。对富集样本Nha-CFC使用流式细胞术分选获得纯种Nha-C细胞，并与Halorubrum lacusprofundi共培养验证两者之间的共生关系。实验中使用透射电镜（TEM）和原位杂交技术（FISH）研究两者相互作用的特征，使用宏基因组和宏蛋白组揭示相互作用分子机制。
1. 南极盐纳古菌的培养
本研究的富集培养方法采用之前分离Halorubrum lacusprofundi R1S1的方法。经过Rauer1湖水（南极洲东部）样本富集培养后，对富集培养物进行了宏基因组测序，测序结果显示47%为Hrr. Lacusprofundi（相对丰度）；43%为盐纳古菌。通过GC分箱、迭代组装和PCR测序，获得属于Rauer1湖盐纳古菌的2个scaffolds，命名为Ca.Nha.antarcticus R1 (Nha-R1)。通过透射电镜（TEM）观察富集样本发现体系中较小的球菌（0.3-1μm）和较大的多型杆状细胞相连。较小的球菌与盐纳古菌形状相似，较大的杆菌与Hrr. Lacusprofundi 相似。本研究通过0.22μm过膜处理分离盐纳古菌与较大杆菌，接种到相同的固体或液体培养基中，均不能正常生长。本研究尝试过一下培养基：成功富集过Nha-R1的培养基、新鲜培养基中添加浓缩的细胞提取物、设定扩散小室，于正常的富集培养中共培养。所设定的培养方式为Nha-R1提供了正常培养方式相同的营养条件，仅仅没有细胞间的直接接触，说明Nha-R1的正常生长需要细胞与细胞之间的接触。为了确认盐纳古菌的培养特性，本研究对Clud湖（南极洲东部）样本进行富集培养，通过对富集培养样本投射电镜观察，发现与Rauer1湖相同的现象。通过宏基因组数据获得了另外一个重组宏基因组，该基因组与Nha-R1的平均核酸相似性和16S rRNA序列相似性均高于99%，证明两次富集实验所得到的微生物属于同一个物种，第二次获得的物种命名为Nha-C，基因组命名为Nha-Ce。该次富集培养中丰度较高的微生物同样也是Hrr. Lacusprofundi（41%）和盐纳古菌（26%）。
2. Na-C与Hrr. lacusprofundi ACAM34-hmgA的共培养
在所有的富集培养中，Hrr. Lacusprofundi均为丰度最高的物种（图1A和B），说明它有可能是宿主微生物。Hrr. lacusprofundi ACAM34-hmgA可以在含有2.5μg/mL的普伐他丁培养基中生长。普伐他丁是一种可以印制HmgA表达的化合物，从而抑制脂类的合成，而在Ca.Nha.antarcticus MAGs中未发现有脂类合成途径，所以普伐他丁不会影响Ca.Nha.antarcticus和Hrr. lacusprofundi ACAM34-hmgA的生长，在培养基中添加2.5μg/mL的普伐他丁可以达到抑制其他微生物生长的作用。为了更好的抑制其他微生物，本研究同时添加了细菌抗生素（100 μg/mL氨卡青霉素，25 μg/mL氯霉素，50 μg/mL卡那霉素，10 μg/mL四环素）。为了选择抗性较强的Hrr. lacusprofundi ACAM34-hmgA，本研究经过几轮对Hrr. lacusprofundi ACAM34-hmgA培养之后，选择10μg/mL普伐他丁的同时添加0.02μg/mL洛伐他丁和0.01μg/mL辛伐他丁，最终获得一株通过转座酶将hmgA基因整合到染色体上的Hrr. lacusprofundi ACAM34-hmgA（其他质粒基因已经丢失或者没有功能）。
在富集培养基中添加10μg/mL普伐他丁进行富集培养，对在生长期的培养样本进行了宏基因组测序。测序结果显示Nha-C和Hrr. Lacusprofundi的相对丰度较高，分别是30%和56%。同时含有低丰度的钠线菌属（8%）和海杆菌属（6%）。该宏基因组中获得了一个重组基因组，命名为Nha-CH1.结合原位杂交技术和特异性探针，本研究揭示了Hrr. Lacusprofundi和Ca. Nha. Antarcticus的生长细胞形态（图3）。Hrr. Lacusprofundi为绿色的多形杆状，长度在1-3μm，Ca.Nha.antarcticus为红色的球型，长度小于1μm。除了单个的细胞，在电镜照片中出现Nha-C和Hrr. Lacusprofundi交联在一起的现象（图3E），没有被有色探针染色但被DAPI染色（蓝色）较大的细胞的为其他微生物。投射电镜照片发现了多形杆状和小球状的细胞。其中，小球状的细胞有的是单独的，有的是与较大的细胞联系在一起的。同时一些照片发现两种细胞融合在一起和一些小球状的细胞正在分裂（图4）。
图3 Hrr. lacusprofundi ACAM34-hmgA与Nha-C共培养下的荧光原位杂交实验。Nha-C携带Cy5基团的探针，显示红色；Hrr. lacusprofundi ACAM34-hmgA携带Cy3荧光基团的探针，显示绿色（原为黄色，为提高对比度改为绿色）；所有细胞使用DAPI染色，显示蓝色
图4 Hrr. lacusprofundi ACAM34-hmgA与Nha-C共培养下的透射电镜照片
3. 使用荧光激活细胞分选术筛选Nha-C并与Hrr. Lacusprofundi共培养
分选样本选择Nha-C相对丰度较高的富集样本（47%），样本命名为Nha-CFC（图2）。首先使用大小珠判定流式细胞仪对细胞大小的分选范围，划定200-800nm的门。用Nha-C特异性探针赋予目标微生物以独特的荧光信号。经过几轮筛选，在400nm左右处获得1,600,000个活细胞，在600nm左右出获得800,000个活细胞。
图2 实验设计：通过与Hrr. Lacusprofundi共培养，实现Ca.Nha.antarcticus的可培养只有三个种微生物均存在于所有的富集样本中，分别是Ca.Nha.antarcticus，Hrr. lacusprofundi和Natrinema sp.（图1）。将从分选得到的细胞接种到培养基中，或者是与Hrr. lacusprofundi ACAM34和Natrinema sp.共培养，通过PCR判定Nha-C是否存在。培养一个月后，在与Hrr. lacusprofundi ACAM34共培养的培养样本中检测到Nha-C，但是在单培养（两个重复）和与Natrinema sp.共培养的样本（四个重复）中没有检测到Nha-C。继续5天后，所有四个与Hrr. lacusprofundi ACAM34共培养的培养重复样本中均检测到Nha-C。将共培养样本转接到新鲜培养基中，对生长过程中的4个时间点进行取样：指数生长早期（8天），指数生长后期（21天），稳定早期（30天），稳定后期（98天）。通过PCR产物条带比较过程中目标微生物的含量，发现最强的条带出现在指数前期，之后条带逐渐变弱。通过DNA测序发现序列与Ca.Nha.antarcticus的相似度为100%。与共培养实验相似，共培养样本FISH图片发现了Nha-C的单细胞或者是与Hrr. Lacusprofundi交联在一起的细胞（图5）。同时，在透射电镜中也发现了大细胞和小细胞之间的相互作用（图6），大细胞可能与1个，2个或多个小细胞联系，与富集培养结果的透射电镜图片相似（图4）。
图5 Hrr. lacusprofundi ACAM34与流式分选出的活细胞共培养下，荧光原位杂交实验
4. Nha-C和Hrr. Lacusprofundi之间的相互作用特征
Nha-C细胞中同时发现了Nha-C和Hrr. Lacusprofundi探针的信号（图5）或者是只有Nha-C探针的信号，表明Hrr. Lacusprofundi的核糖体RNA可以转移到Nha-C细胞内，进一步的两者之间可以进行直接的细胞质转移，在其他研究中也发现了类似的现象。通过FACS和富集培养实验的图片发现细胞间存在很小的分离层，因此细胞间的交联有可能与胞外物质有关（图6E）。细胞融合代表存在共用的脂质膜（图6B-D），膜颈结构可能与芽裂或者是裂变有关（图4E和F）。同时，在透射电镜图片中发现小细胞往外延伸的长状结构（700x60nm），根据FISH图像显示，只有Hrr. Lacusprofundi探针的荧光信号，证明这些物质来源于Hrr. Lacusprofundi。这些可能是胞质桥的残余，就像Parvarchaeota和他的宿主。
一些小细胞附着在大细胞上出现了分裂的现象（图6B和C）。而存在单独分裂的小细胞，但是并没有附着在大细胞上。可是是未附着的Ca.Nha.antarcticus在离开Hrr. Lacusprofundi之前完成了细胞的分裂的结论，也有可能是因为Ca. Nha. Antarcticus已经获得了足够的能量，可以在一定范围内完成细胞分裂。
虽然Hrr. lacusprofundi ACAM34可以实现Nha-C FACS细胞的生长，但是没有富集培养过程中的生长速度和浓度高。富集培养过程中，可以允许多种Hrr. Lacusprofundi的生长，而在共培养实验中菌株的多样性由于抗生素的筛选变的很低。富集培养可以使得更多的物种之间存在相互关系，提供代谢产物，改变Hrr. Lacusprofundi的生理机能，从而促进Ca.Nha.antarcticus的生长。目前根据报道，不同株的Hrr. Lacusprofundi在很多方面都存在差异。本研究使用富集培养和FACS实现了Nha-C的培养、纯化，和Hrr. Lacusprofundi共培养和验证，本研究所提供的结果符合科赫原则所需要的假设。
图6 Hrr. lacusprofundi ACAM34与流式分选出的活细胞共培养下的透射电镜照片
5. 相互作用的分子机制
盐纳古菌基因组最明显的特征是存在编码很长“SPEARE”蛋白的核酸序列（高达8,553个氨基酸序列），这个蛋白包括丝氨酸蛋白酶、粘附结构域、限制性核酸内切酶域（图7A）。Ca.Nha.antarcticus的该蛋白长度为5,998个氨基酸，Ca. Nanopetramus SG9的长度为8,553-，4,057-，3,315和665个氨基酸。通过匹配对比，在3个不完整的组装中也发现了相似的蛋白，与Lake Tyrrell来源的序列具有较高的匹配度（图7B）。在Ca. Nanopetramus SG9发现的蛋白在古菌中属于第二长，占全部基因组的4%。大部分SPEARE蛋白被认为大部分的蛋白长度都是在胞外的，在C端具有一个跨膜结构域，可以将蛋白质锚定在膜上，而C端区域位于膜内（图7A）。而Ca. Nanopetramus SG9的蛋白相反，它的跨膜结构在N端（图7B）。SPEARE蛋白最保守的区域是胞内的部分，主要的特征为III型的核酸内切酶（作用于DNA降解）。胞外部分序列差异较大，但是随意的胞外部分都有一个层粘连蛋白G结构域和几个其他的粘附结构域（图7B）。Ca.Nha.antarcticus的该蛋白中还包括不同的丝氨酸蛋白酶（1-1500的氨基酸）和细菌毒素（3300到4800个氨基酸）结构域。本研究预测了细菌毒素的三级结构，发现与ABC毒素复合物的细菌BC毒素亚基相似，该毒素与膜孔的形成有关。本研究预测的粘附蛋白的序列与几个细菌基因组中的序列存在较高的相似度（25-35%），这些细菌与其他生物体普遍存在附着寄生的生活方式。蛋白组分析结果显示Nha-C合成了SPEARE蛋白。蛋白胶电泳结果显示该蛋白具有较高的丰度（>315kDa）。通过MS分析胞外蛋白部分发现了81种不同的多肽（接近550-kDa），这些多肽属于跨膜部分和胞质部分的少于315kDa。不同大小的胞质和跨膜蛋白有可能是翻译后修饰或者是测序过程中造成的。本研究发现了近乎完整表达的蛋白，于是接着对该蛋白的功能进行研究。蛋白中的粘附域可以促进物理相互作用，通过丝氨酸蛋白酶活性降解宿主的S层。锚定区域可能会帮助正确定位细菌毒素结构域，然后形成膜孔，促进细胞质的进出。通过胞内的限制性核酸内切酶结构域可以降解进入细胞内的遗传物质，这种活性可能有助于减少吸收DNA带来的负面影响，并为复制提供核苷酸资源。
图7 SPEARE蛋白的主要结构。A Ca.Nha.antarcticus的SPEARE蛋白结构预测；B 比较不同MAGs来源的SPEARE结构
6. 盐纳古菌的代谢和细胞能力
盐纳古菌缺乏必要成分的合成途径，比如脂类、氨基酸、核酸和辅酶因子，因此该微生物具有极强的宿主依赖性。古菌甲羟戊酸途径的基因是相对保守和容易辨认的，而盐纳古菌缺乏该途径基因，证明不具备磷脂合成能力。基因组和蛋白质组数据表明Ca.Nha.antarcticus具有耐氧、异养、发酵的特征。同时Ca.Nha.antarcticus具有自我合成碳水化合物的能力，除此之外，其他合成能力极度受限，Ca.Nha.antarcticus需要从宿主中获得特定的生物聚合物，包括多肽、核酸等。可以得出，Ca.Nha.antarcticus在于宿主接触的时候，获得必要的代谢产物，储备碳源，以至于自己离开宿主之后可以维持生命活动。
7. 盐纳古菌基因组差异以及进化
本研究收集了2个西福尔丘陵湖（Deep湖和Clud湖）、4个劳岛湖的宏基因组信息。Deep湖含有37个宏基因组样本（8年，包括季节循环和不同深度）。Deep湖宏基因组中盐纳古菌的read覆盖率约为0.5%，与Club湖相似，Rauer Island湖的覆盖率变化更大，最高的覆盖率为3.5%，来自于Rauer3湖。虽然盐纳古菌的相对丰度很低（<3.5%），但Contig和read的相似度很高，contig的相似度可达到>99%，说明在盐纳古菌的基因组差异较小。对测序数据分析发现，存在短序列测序深度较高的现象，其中含有移动因子（转座子），与南极Halorubraceae的序列相似度较高，说明这些序列是从Halorubraceae中获得的。Contig之间的gaps包含相似的序列（转座子、病毒基因、假定蛋白），这些多数与Halorubraceae的序列相似。值得注意的是，完整的V型噬菌体排斥系统（BREX）在Nha-CHl中存在但是在Nha-R1中不存在，BREX可抑制病毒复制。BREX基因的下游存在一个基因，该基因的注释结果为盐纳古菌的假定蛋白，有可能是盐纳古菌特异性的BREX基因。BREX簇旁边是一个被标注为病毒整合酶的基因，根据平均覆盖率表明BREX基因本身可能是一个移动基因。虽然南极洲盐纳古菌的基因组差异较小，但非南极盐纳古菌的基因组相似性要低得多(≤70% ANI, <90% 16S rRNA gene identity），这表明在高盐环境中盐纳古菌具有较高的多样性，同时在盐纳古菌属水平的多样性与Halorubraceae相似，有可能与盐纳古菌宿主特异性有关。如果存在共同进化，盐纳古菌的每一个谱系都可能与特定的Halorubraceae谱系发生相互作用。本研究针对南极洲湖水中的盐纳古菌的可培养情况进行研究，首先成功富集到含有高丰度盐纳古菌的富集样本，通过透射电镜，荧光原位杂交以及宏基因组数据统计发现盐纳古菌与Halorubrum lacusprofundi存在共生关系，作者基于科赫原则设计实验，证明两者之间的共生关系，以及直接接触和细胞质摄取是共生关系的特征。进一步通过蛋白质组学揭示了普遍存在的大分子蛋白SPEARE可能是接触性互作关系的分子机制。本研究有效地扩展了古细菌共生生活方式的认知范围，并为进一步了解微生物共生关系机制提供了一种可参考模型。
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