小麦白粉菌Effector

1. 前言

白粉菌属于子囊菌亚门，为专性寄生的活体营养型真菌，其中Blumeria graminis (B.g.)根据寄主不同可分为B. g. tritici (Bgt，wheat，小麦白粉菌)，B.g. hordei(Bgh，barley，大麦白粉菌)，B. g. secalis (Bgs，rye，黑麦白粉菌)，B.g. avenae(Bga，oat，燕麦白粉菌) ，B. g. triticale (triticale，B.g. triticix B. g. secalis，小黑麦白粉菌)，B. g. dactylidis(Bgd，Dactylis glomerata，鸭茅白粉菌)等。针对活体专性寄生的病原菌，植物体内存在NBS-LRR类型的抗病(R)基因，当R基因特异识别病原菌中毒性相关的effector即无毒基因(Avriulence gene, Avr)时，植物才能产生一系列抗性反应，如超敏反应(HR)等。以下论述主要来自瑞士苏黎世大学(University of Zurich)Beat Keller 实验室的相关研究。

2. 小麦白粉菌Avr的克隆

Sánchez-Martín等通过突变体染色体分离测序技术克隆了位于5DS上的NBS-LRR类抗病基因Pm2(Sánchez-Martín et al., 2016)。利用对Pm2无毒的白粉菌株96224(配合型为MAT1-2)和有毒的白粉菌株JIW2(配合型为MAT1-1)进行异宗杂交产生单倍体F₁后代群体，对该群体借助含有Pm2基因的近等基因系Ulka/8*Chancellor、Federation*4/Ulka和CI12632/8*Chancellor进行毒性检测，发现该群体A:V (无毒：有毒)分离比为1:1，说明白粉菌对Pm2的毒性由单个AvrPm2位点控制。同时利用42个小麦白粉菌(12个毒性白粉菌株和30个无毒白粉菌株)和18个小黑麦白粉菌重测序数据进行全基因组关联分析(GWAS)，克隆到无毒基因AvrPm2，并利用农杆菌介导的本生烟(Nicotina benthenmiana)瞬时转化实验证明了AvrPm2可以被Pm2特异识别且引起HR反应。分析发现AvrPm2基因处于转座元件(transposable element，TE)含量较高的基因组区域，被5个Copia类型的反转座子包围，且相邻反转座子方向相同，推测在毒性白粉菌株中转座子发生重组导致包括AvrPm2区域在内的12 kb序列缺失，从而产生毒性(Praz et al.，2017)。

Bourras等对抗白粉病基因Pm3位点多个等位基因(Pm3a-f)均无毒的白粉菌株96224和有毒的白粉菌株94202的单倍体F₁代群体进行毒性检测，发现如图1所示的遗传分离比及各个遗传位点可能的互作方式，并成功克隆了位于locus_2的AvrPm3^a2/f2，进一步利用农杆菌介导的本生烟瞬时转化实验证明AvrPm3^a2/f2可以被Pm3a和Pm3f特异识别且引起HR反应。AvrPm3^a2/f2与毒性的avrPm3^a2/f2只有2个氨基酸的差异，且每个差异氨基酸对R基因识别都很重要。locus_1位点的SvrPm3^a1f1作为Avr的抑制因子在小麦白粉菌中参与对Pm3a-f的识别，且其抑制作用与表达量有关(Bourras et al.，2015)。

图1 小麦白粉病菌F1分离群体在不同Pm3等位基因材料上的抗性反应(Bourras et al.，2015)

小麦白粉菌基因组大小为150-180 Mb，90%为TE序列，约含6500个预测的基因，其中10%的基因编码候选的分泌效应因子蛋白(candidate secreted effector proteins，CSEPs)，CSEPs与白粉菌-寄主的识别有关，是Avr的候选基因(Praz et al.，2017)，之前克隆的AvrPm3^a2/f2，AvrPm2均为CSEPs。

Bourras等根据在Bgt中克隆的AvrPm3^a2/f2和AvrPm2，以及在Bgh中克隆的Avr_a1和Avr_a13等总结了白粉菌Avr蛋白的一些特征(图2)：

(1) 大都编码信号肽 (SP)，具有YxC motif且具有1个保守的Cys；

(2) 蛋白大小为118-130 aa，且具有相似的结构；

(3) 在吸器形成时期表达量高；

(4) 基因序列在无毒及有毒的白粉菌株具有多态性。

图2 小麦白粉病菌无毒基因AvrPm3^a2/f2结构(Bourras et al., 2016)

Bourras等根据这些特征在白粉菌基因组中可富集到约580个潜在的effectors，同时利用100个白粉菌株重测序数据进行GWAS分析，得到6个候选基因，将富集到的前100个可信度最高的effectors和这6个候选effector利用农杆菌介导的本生烟瞬时转化体系进行检测，成功克隆了位于locus_3的AvrPm3^b2/c2，但该基因在两个毒性和无毒白粉菌株中序列相同，推测其功能在毒性白粉菌株中被SvrPm3^a1f1抑制；他们同时还克隆了AvrPm3^d3，该基因是旁系同源基因重复的产物，在毒性白粉菌株中缺失(Bourras et al.，2019)。

3. Avr/R/Svr遗传模型

与此同时，他们还在白粉病菌中还鉴定出可抑制Avr基因毒性的抑制因子Suppressor of avirulence (Svr)。综合抗白粉病基因R与白粉菌Avr基因以及Svr的互作关系，Bourras等提出Avr-R-Svr遗传模型(图3)：Avr与R基因的识别是由Avr和avr的序列差异和Svr和svr的活性共同决定的，在无毒白粉菌株里组合为svr/Avr，有毒白粉菌株组合为Svr/avr，Svr可以抑制Avr与R基因的识别，即使Avr存在，病原菌仍可以逃避R基因的识别，只有在Avr/R/svr组合下植物才能产生抗病反应，当缺少Avr或Svr时，都无法引起抗病反应(Bourras et al.，2015)。

图3 Avr/R/Svr遗传模型(Bourras et al.，2015)

4. Avr-R互作参与等位基因间的抑制

Pm3位点存在等位基因间相互抑制的现象，如Pm3a/f的抗性可以被Pm3b/c抑制，研究表明Pm3b/c可抑制AvrPm3^a2/f2与Pm3a/f识别引起的HR反应，证明了等位基因之间的抑制是由于抑制了Avr与R基因之间的识别导致的(Bourras et al.，2015)。

5. AvrPm3系统发育树和单倍型分析

系统发育树分析表明，AvrPm3^a2/f2和AvrPm3^b2/c2属于同一个超家族，与AvrPm3^d和SvrPm3^a1f1均不在一个家族。虽然AvrPm3之间序列相似性很低，但预测蛋白的二级结构及三级结构相似(Bourras et al.，2019)。

将AvrPm3^a2/f2在世界各地采集的272份不同的白粉菌株中进行基因扩增，发现了12种单倍型(AvrPm3^a2/f2-A-H，AvrPm3^a2/f2-J-M)(McNally et al.，2018)；在185份白粉菌株中发现了11种AvrPm3^b2/c2单倍型(AvrPm3^b2/c2-A-K)。分析发现在所有检测的小麦白粉菌中皆存在AvrPm3位点，具有活性的Avr单倍型占的比例较高，没有发现像AvrPm2一样的序列缺失和转座元件插入的情况，推测可能是由于Svr的存在使得AvrPm3位点在白粉菌中得以较好的保留。这些新发现的单倍型大部分无法被对应的Pm3等位基因识别，单个氨基酸的变异也会导致无法发生R基因与Avr的识别，说明躲避R基因识别的选择压力是导致Avr序列多态性的驱动力，在多样性选择的压力下，产生了可以不被R基因识别的新单倍型(图4, Bourras et al.，2019)。

图4 AvrPm3^a2/f2和AvrPm3^b2/c2的地理分布和频率(Bourras et al.，2019)

单倍型分析发现，不同AvrPm3蛋白序列变异集中的部位不同，如AvrPm3^b2/c2的突变主要集中的N端，而AvrPm3^d3主要集中在C端，也就是说不同的Avr参与识别R基因的结构域可能不同。将AvrPm3^b2/c2分成不同的结构域，利用无法被Pm3基因识别的同源基因序列进行结构域切换实验，结果表明Avr与R基因的识别依赖于多个结构域，且这些结构域包括了自然群体中序列变异高度集中的区域，说明这些突变集中区域对Avr与R基因的识别起着至关重要的作用(图5)(Bourras et al.，2019)。

图5 AvrPm3^b2/c2的结构域替换实验(Bourras et al.，2019)

6. Avr-R互作在白粉菌寄主特异性中起着重要作用

AvrPm3^a2/f2、AvrPm3^b2/c2和AvrPm3^d3在B.g. dactylidis中对应的同源基因分别是AvrPm3^a2/f2-Bgd，AvrPm3^b2/c2-Bgd和AvrPm3^d3-Bgd；在B.g. secalis中的同源基因是AvrPm3^b2/c2-Bgs和AvrPm3^d3-Bgs；AvrPm3^a2/f2在B.g. secalis中无同源基因。本生烟瞬时转化证明虽然有氨基酸序列的差异， AvrPm3^b2/c2-Bgs依然可以被小麦Pm3b/c特异识别，AvrPm3^d3-Bgd 和AvrPm3^d3-Bgs同样可以被小麦Pm3d特异识别，即Pm3基因可以特异识别来自B.g. dactylidis和B.g. secalis中对应的AvrPm3的同源基因(Bourras et al.，2019)。

一般认为白粉菌由于寄主专化性，黑麦白粉菌(Bgs)无法侵染小麦植株。通过显微镜观察，发现用黑麦白粉菌(Bgs_1391和Bgs_1495，这两个白粉菌中的SvrPm3^a1f1没有活性)接种不含抗病基因的小麦品种“Bobwhite”时，虽然没有肉眼可见的白粉菌，但可形成一定数量的微菌落。与对照“Bobwhite”和“Chancellor”相比，同样接种黑麦白粉菌B.g. secalis之后，含有Pm3b和Pm3d的转基因材料(“Bobwhite”背景)和含有Pm3b、Pm3c的近等基因系(“Chancellor”背景)的微菌落指数显著降低(图6)，说明Pm3基因可以通过识别黑麦白粉菌B.g. secalis中的对应Avr同源基因来抑制黑麦白粉菌在小麦上的生长，提高对非寄主白粉菌的抗性(Bourras et al.，2019)。

图6 AvrPm3与Pm3的识别保守性(Bourras et al.，2019)

Avr-R对非寄主白粉菌的特异性识别起着关键作用，从理论上解释了小麦野生亲缘种中的R基因，如来自簇毛麦的Pm21，黑麦的Pm8和Pm17导入到普通六倍体小麦中依然可以发挥白粉病抗性的原因。非寄主的白粉菌可以在感病小麦上产生一定数目的微菌落为其与寄主专性寄生的白粉菌杂交提供了机会，从而产生具有更广寄主范围的新白粉菌株，如黑麦白粉菌(Bgs)和小麦白粉菌(Bgt)杂交而形成小黑麦白粉菌(B. g. triticale) (Menardo et al., 2016; Bourraset al.，2019)，导致了抗白粉病基因Pm8在全球的抗性丧失。

7. Avr-R互作对小麦育种的启示

如果病原菌中Avr功能丧失的同时，在生产上大面积应用缺失对应R基因的小麦品种易导致新的病原菌株的形成和流行。如麦瘟病菌毒性菌株的形成是由于含有rwt3(缺失Rwt3抗性基因)的小麦品种大面积应用和麦瘟病菌中PWT3(Rwt3基因对应的Avr)功能的丧失，产生了寄主跃迁现象(host jumping, Inoue et al., 2017)。因此小麦中一些重要的R基因(如Pm2、Pm3和Pm8等)即使抗性已经被毒性白粉菌株克服，在今后育种中也应该保留和利用，这些R基因可以抑制非寄主病原菌的寄生，从而减缓新的毒性白粉菌株形成速度(Bourras et al.，2019)。

主要参考文献

1. Bourras S，Kunz L，Xue M，Praz CR，Muller MC，Kalin C，Schlafli M，Ackermann P，Fluckiger S，Parlange F，et al. (2019) The AvrPm3-Pm3 effector-NLR interactions control both race-specific resistance and host-specificity of cereal mildews on wheat. Nat Commun 10(1): 2292.

2. Bourras S，McNally KE，Ben-David R，Parlange F，Roffler S，Praz CR，Oberhaensli S，Menardo F，Stirnweis D，Frenkel Z，et al. (2015) Multiple avirulence lociand allele-specific effector recognition control the Pm3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew. Plant Cell 27(10): 2991-3012.

3. Bourras S, McNally KE, Muller MC, Wicker T, Keller B. (2016) Avirulence genes in ceral powdery mildew: the gene-for-gene hypothesis 2.0. Front in Plant Sci. 7:241

4. Inoue Y，Vy TTP，Yoshida K，Asano H，Mitsuoka C，Asuke S，Anh VL，Cumagun CJR，Chuma I，Terauchi R. (2017) Evolution of the wheat blast fungus through functional losses in a host specificity determinant. Science 357(6346): 80-83.

5. McNally KE，Menardo F，Lüthi L，Praz CR，Müller MC，Kunz L，Ben-David R，Chandrasekhar K，Dinoor A，Cowger C，et al. (2018) Distinct domains of the AVRPM3A2/F2 avirulence protein from wheat powdery mildew are involved in immune receptor recognition and putative effector function. New Phytologist 218(2): 681-695.

6. Menardo F, Praz CR, Wyder S, Ben-David R, Bourras S, Matsumae H, McNally KE, Parlange F, Riba A, Roffler S, et al. (2016) Hybridization of powdery mildew strains gives rise to pathogens on novel agricultural crop species. Nat Genet. 48, 201–205

7. Praz CR，Bourras S，Zeng F，Sanchez-Martin J，Menardo F，Xue M，Yang L，Roffler S，Boni R，Herren G，et al. (2017) AvrPm2 encodes an RNase-like avirulence effector which is conserved in the two different specialized forms of wheat and rye powdery mildew fungus. New Phytologist 213(3): 1301-1314.

8. Sánchez-Martín J, Steuernagel B, Ghosh S, et al. (2016) Rapid gene isolation in barley and wheat by mutant chromosome sequencing. Genome Biology 17:221