细菌纳米管是啥？真能连接细菌和哺乳动物细胞？
这是《肠道产业》第 774 篇文章
编者按
十年前，有学者发现了一种由脂质构成的细菌导管，其不仅能连接不同种类的细菌，甚至可以连接细菌和哺乳动物细胞，而且有研究提出该导管允许氨基酸和毒素等物质的转移。但也有人提出这些导管可能是人为污染。那么这种导管真实存在吗？
今天，我们共同关注细菌纳米管。希望本文能够为诸位读者带来一些启发和帮助。
全新特征：细菌纳米管
2011 年，微生物界了解到了细菌的一个全新特征：纳米管（Nanotubes）。不久后科学家们还发现，细菌间的这些膜状中空管状结构，允许氨基酸和毒素等物质的转移。
这些管状结构与科学家们之前见过的都不同，这些纳米管是由脂质而非蛋白质组成的。它们比菌毛更混杂，经常能够联结不同物种的微生物，甚至能将细菌与哺乳动物细胞相连。细菌纳米管看起来似乎是微生物学中长期被忽视的特征。
捷克科学院的研究生 Jiří Pospíšil 对这些新兴的细菌结构非常着迷，因此在他攻读 RNA 聚合酶方向的博士两年之后，也就是 2016 年，开始研究纳米管。但当开始复制一些首次将纳米管可视化的研究时，他很快就碰壁了。
尽管进行了一系列不同的实验，但他仍然无法再现之前的研究结果。虽然他偶尔会发现细胞之间形成的纳米管，但这种情况发生的很少，而且往往只发生在特定条件下。这让 Pospíšil 对于纳米管在微生物界的普遍性和重要性产生了怀疑。
不过 Pospíšil 没想过要放弃，因此他与斯洛伐克科学院的 Imrich Barák 进行了合作。Barák 可以使用更为复杂的成像技术，Pospíšil 说，他希望能借此观察到这种独特的结构。
利用载玻片和盖玻片，Pospíšil 和 Barák 共同制备了用于显微镜观察的枯草芽孢杆菌。有一天，他们看到载玻片上的细胞在移动。为了固定这些细胞，Barák 说，“我们就决定将盖玻片向下压”。当他们这样做时，他们看到纳米管几乎从每个细胞中迸发出来。更仔细的观察之后，Pospíšil 和 Barák 发现细胞正在衰亡。
这一观察结果发表于 2020 年十月，与所有先前发表的针对纳米管的文献截然相反，因为此前的文献认为，这种结构是活的健康细胞之间的导管。
Barák 说，如果纳米管确实是凋亡细胞的特征，那么“这一结构是转运对于微生物生长和存活所需物质的核心”这一假设就不太可能是真的，“我们意识到，这可能意味着存在着具有不同功能的纳米管。”
什么是细菌纳米管？
与很多科学进步一样，细菌纳米管也是偶然间被发现的。2008 年，以色列耶路撒冷希伯来大学的微生物学家 Sigal Ben-Yehuda 和她的研究生当时正在研究枯草芽孢杆菌的孢子形成。
他们其中一个实验包括了两种枯草芽孢杆菌的混合物，其中一种表达绿色荧光蛋白（GFP），另一种不表达，在该实验中，两种微生物被置于同一环境一起生长。通过光学显微镜观察，他们发现一些原本不表达绿色荧光蛋白的细胞也有微弱的荧光，而且这些细胞与表达绿色荧光蛋白的细胞离得很近。
先前在巴斯德研究院工作的研究人员Bubey说：“我认为，这里发生了一些不为人知的物质交换。”
为了弄清楚发生了什么，Ben-Yehuda 和 Dubey 进行了一系列实验。他们利用另一些荧光小分子（如钙黄绿素）进行了实验，发现这些小分子同样会在细胞间“跳跃”，质粒、RNA 这样的基因组材料也同样如此。
细菌可以通过不依赖于接触的系统（如简单扩散和囊泡），或是依赖于接触的系统（如接合菌毛和分泌系统），进行物质交换。但是科学家们观察到，即便是在那些没有已知转运机制的枯草芽孢杆菌中也存在物质交换。Ben-Yehuda 说：“这让我们想到，可能存在一些我们以前不知道的交换。”
当她和 Dubey 利用高分辨率电子显微镜观察枯草芽孢杆菌时，他们看到了细菌延伸到相邻细胞的管状结构。Ben-Yehuda 说：“我们可以反复多次地观察到它们。”
令人惊奇地是，这一结构从未被报道过。他们翻阅了过去那些论文中细菌的电子显微镜图像，令他们高兴的是，他们可以在各种情况下看到这些细菌纳米管。Ben-Yehuda 认为这些细菌纳米管之所以一直被忽略，是因为没有人真正意识到它们是什么。2011 年，该团队发表了论文，首次报道了用于联结细菌细胞的细菌纳米管的存在。
在细菌纳米管被发现之前，人们所知道的唯一能在细菌细胞间转运物质的接触性系统是由蛋白质组成的，而且研究人员也发现，这些管道所连接的细胞有着一定的限制，比如接合菌毛仅会在携带特定质粒的细菌与携带特定受体的细菌之间形成。
Ben-Yahuda 的团队发现，不像那些以蛋白质为基础的系统，纳米管几乎都是由脂肪组成的，而且看起来对于它们联结的细胞也并不挑剔。纳米管常常看起来像一系列连在一起的囊泡，它们的长度各异，而且会促进细胞之间的细胞质连接。这种细胞质间的连接恰恰将纳米管与革兰氏阴性菌的膜外囊泡区分开来，后者是用于包裹和分泌物质的结构。
Ben Yehuda 的团队想了解细菌纳米管的分布到底有多广泛，他们测试了很多种其他的细菌。他们的隔壁是由 Ilan Rosenshine 领导的实验室，主要研究致病性大肠杆菌（EPEC），这种细菌会依附于宿主细胞上，通过一些不为人知的分子机制来汲取营养。Ben-Yehuda 认为，这种机制可能是纳米管。
她与 Rosenshine 联系，请他分享一些 EPEC 样本给她。2019 年，他们共同发表了两篇论文，其中一篇报道了 EPEC 在依附到宿主细胞时会产生纳米管。另一篇则表明，纳米管能够连接革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，而且实现这种连接，细菌需要一组被称之为 CORE 复合体的蛋白（共 5 种）。缺少这组蛋白的 EPEC 和枯草芽孢杆菌都无法产生纳米管。
Ben-Yahuda 说：“我们无法想象，这些不同的系统，从 EPEC 到芽孢杆菌都是一样的。”
同时，其他实验室也在他们自己的细菌体系中记录了纳米管的存在。2015 年，德国奥斯纳布吕克大学的 Christian Kost 和她的同事们对两种细菌（大肠杆菌和贝氏不动杆菌）进行了基因改造，使它们分别缺少一种氨基酸，因此它们只有在共同生长并存在物质交换的情况下才能存活。
研究人员利用荧光标志物标记氨基酸，并使用显微镜进行观察，结果发现，两种细胞之间的氨基酸在交换。他们追踪了这些荧光标记物随时间的运动情况，发现这种交换是通过这种由脂肪组成的管状结构发生的。利用电子显微镜，科学家们随后确认了这种结构为细菌纳米管。
同一年，法国国家科学院和艾克斯-马赛大学的 Marie-Thérèse Giudici-Orticoni 团队发表了一篇论文，报道说在丙酮丁醇梭菌（革兰氏阳性菌）和脱硫弧菌（革兰氏阴性菌）之间发现了类似纳米管的连接。在利用扫描电镜和其他技术观察时，他们发现这种细胞间的连接可以让细胞在严苛的生长条件下（如营养缺乏时）进行物质交换并得以存活。
在 2020 年，纽卡斯尔大学的 Jinju Chen 团队记录了铜绿假单胞菌中存在纳米管，这是一种常见于医院并能形成生物膜的病原体。
纳米柱是一种常用于医疗设备表面，以阻止有害生物膜形成的微小尖刺。面对纳米柱时，这种细菌能够将自己排列在纳米柱之间，并利用纳米管与其他细胞连接。由于该细菌无法产生其他如菌毛等连接性的结构，因此该团队确定，他们所看到的这种连结性结构确实是纳米管。他们总结说，纳米管可能便利了细菌之间的交流，从而促进细胞在适宜的环境中产生生物膜的能力。
考虑到有如此多的实验室在不同条件下的活跃生长的细胞中，都观察到了细菌的纳米管，因此，Pospíšil 没想到他做同样的事情会遇到困难。
难以捉摸的结构
当 Pospíšil 刚开始观察细菌纳米管时，他很快就注意到，这种结构被观察到的频率远比 Ben-yehuda 实验室所报道的要低得多。Pospíšil 的导师 Libor Krásný 说：“研究纳米管最大的挑战在于，切实地检测到纳米管。”事实上，每扫描 500 多个细胞，他们才能发现一个纳米管。
捷克科学院微生物研究所电子显微镜团队的领导 Oldřich Benada 说：“我们'看到’了像纳米管一样的东西，但是频次非常非常低。而且我们必须要扫描很多画面才能发现一些这种结构。”他说，他对于纳米管到底是否存在抱有怀疑。
在他们探索纳米管很多年之后，Krásný 在一次会议中遇到了 Ben-Yehuda，讨论了他的团队在观察这一结构时所遇到的困难，之后 Ben-Yehuda 给他们提供了一些自己实验室之前在用的细菌菌株和相关记录，但是捷克的团队仍然无法看到纳米管。研究人员也进行了尝试，但并不能够重现 Ben-Yehuda 的实验室先前所进行的一些物质交换实验。
当 Pospíšil 与他斯洛伐克科学院的同事 Barák 无意中压到载玻片，他们才发现，这会让细菌产生很多纳米管。他们立即开始测试多种压力值，以探寻哪一种最可能让细胞产生纳米管。他们发现，施加约 80 千帕压力时，即在盖玻片上放置一个 2.5 公斤的重物 10 秒，几乎每个细胞都立即产生许多延伸出去的纳米管。
当 Pospíšil 利用一种名为 SYTOX Green 的标志物（仅会使衰亡中或已死亡的细胞着色）时发现，纳米管仅由那些被染绿的细胞产生。这也让他明白，这种压力会杀死细胞，最终造成纳米管的产生。
考虑到压到盖玻片只是一个常规操作，因此，Barák 说，他认为之所以压力诱导的纳米管先前并未被报道，是因为人们们总是习惯忽略已经死亡的细胞。他补充说，在过去几十年间，给细胞膜染色、压盖玻片这种操作中，“我甚至都从未观察到纳米管，因为我们根本不会专注于它们。”现在，他明白了，如果他小心地固定好这些细胞并使用一台良好的显微镜，他将很有可能看到纳米管。
Barák 说，当该团队于 2020 年 12 月发表其研究成果后，来自科学界的反响大多是积极的。该论文在推特被广泛转发，并收到了一些怀疑纳米管是否切实存在的科学家们的评论。
Alex Merz 是华盛顿大学的生物化学家，他曾公开批判了 Ben-Yehuda 实验室的一些论文，特别是近期的一篇文章。
该文章详述了 CORE 复合体的作用并表明纳米管可以连接革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌。这两类细菌有着截然不同的细胞被膜，当纳米管从革兰氏阳性菌延伸到革兰氏阴性菌时，它是只会与革兰氏阴性细菌的外膜相互作用，还是会与细胞的内层膜相互作用？
Merz 说，他认为要弄清细菌纳米管是真实存在的功能性结构，还是人为现象，了解这些问题的答案至关重要。他呼吁使用更高分辨率的显微镜技术，这可以使得人们更仔细地观察到纳米管是如何与两种类型的细菌的被膜相连的，而这些技术并未被用于近期的这些论文中。他说：“我需要看到更多实证才能被说服。”
约翰霍普金斯医学院的生物化学家 Erin Goley 与 Merz 怀有同样的担忧。她说：“对于它们是否是真实具有功能的结构，我很怀疑。”除了纳米管的组织方式外，她还对纳米管看似多面手的特性感到困惑。迄今为止，几乎所有依赖于连接的系统都有着自己严格的调控机制，而令 Goley 感到奇怪的是，纳米管似乎缺少这种调控。
与 Merz 相同，她也希望能够看到纳米管更高质量、跨区域的图像，特别是在它们与细菌细胞的连接之处。Goley 和 Merz 都推荐的这种技术可以帮助科学家们减少在传统制样过程中发生的人为污染，并使得细胞维持其原本的状态，这有利于“展现出这些薄膜上实际发生的现象——是什么连接了什么，哪些膜与哪些物质所连接。”Goley 说。
Kost 说，他认为，Czech 的团队所看到的压力诱生的纳米管可能表明了脂质从死细胞中爆发出后的自我组织（self-organization），这与一项过去的研究相似。该研究中表明，原初生命体是一种能够与周围环境相互作用的自组织脂质囊泡，在一定条件下可以形成长的脂质管。
他补充说：“我认为，在某种情况下细胞的确会出现这种现象。但是这很显然不能排除纳米管可能在活细胞中有一定作用。”
Ben-Yehuda 的团队支持这一研究，该实验室的博士后 Amit Baidya 说：“我们并未将细胞置于任何压力之下。”Ben-Yehuda 也指出，他们观察到的细菌菌落在产生纳米管后仍然能够生长、分裂。
但是，即便是在她的实验室，研究人员有时候也需要很努力地观察纳米管。主要的挑战在于缺少纳米管的标签，这迫使科学家们必须依赖于膜染色而且往往会生成许多干扰的图像。
Ben-Yehuda 说：“就像是看太阳之后尝试看一些非常微小的事物。”Baidya 认为，鉴定纳米管的过程需要仔细对待。“制样时，你必须非常非常小心，”他说，“如果你某天不够专注，或是非常着急，你都不会看到纳米管。”
为什么难以重复？
关于细菌纳米管的研究在许多方面都存在差异，包括使用的菌种或菌株、生长条件、检测物质交换的方法以及使得这些结构可视化的显微镜技术。而且，就像 Pospíšil 的研究所指出的，不是所有的实验室都能在所有条件下成功发现纳米管。
哈佛医学院光学显微镜设备主管 Paula Montero Llopis 说，已知温度、酸度和空气等生长条件，都会影响细胞生理学和外观的因素。比如说，枯草芽孢杆菌会以两种形式呈现：能够自由移动的游动孢子，以及由与其他细胞连接的无法移到的细胞链。
Montero Llopis 的工作已经表明，在低温的含有酪蛋白水解物（氨基酸来源）的培养基中，细胞更容易形成后一种形式。她表示：“我发现游动孢子与链状结构的数量分布很大程度上由培养细胞的方式所决定。”
在研究纳米管时，Pospíšil 和 Kost 都使用了液体培养基，而 Ben-Yehuda 的实验室则使用固体琼脂培养皿来培养细菌。Pospíšil 和 Kost 都未能观察到固体培养基中细菌的纳米管，而 Ben-Yehuda 也没观察到液体培养基中的细菌纳米管。
Kost 将不同的实验结果归因于每个实验室所研究的细菌种类不同：Ben-Yehuda 的实验室研究的枯草芽孢杆菌是一种土壤细菌，倾向于在固体表面成长，而 Kost 实验室研究的大肠杆菌则更“喜欢”液体培养基。
Kost 指出，即便是尝试复制另一些实验室的研究，最终的比较结果也会很诡异。而且，当他的实验室从一所大学搬到另一所大学后也面临着同样的问题，“我们尝试尽可能地复制我们用过的所有材料，但是谁知道是否真的很好地复制了呢？”Kost 解释说，不只是不同供应商提供的产品有所差异，即使是使用相同供应商的材料来培养细菌或者进行细菌成像，不同批次的化学试剂也会对实验的重复性造成阻碍。
这些差异同样存在于科学家们在进行细菌成像前的准备工作以及所使用的成像技术中。
当制备用于电子显微镜观察的细菌样品时，最常见的两个步骤就是晾干细胞并喷金。Merz 说：“这些技术……可能是非常粗犷的，它们确实会带来很大的人为污染的风险。”
他也提醒道，应当避免使用化学方法固定，这种技术利用多聚甲醛等化学物质在一定时间内“冷冻细胞”，因此更有可能出现人为污染。同样是利用电子显微镜观察纳米管，不同的实验室所使用的成像技术和制样技术也可能差异很大。
对于怀疑纳米管是否真实存在的人来说，观察纳米管时所需的不同的（甚至有时候相反的）条件是不容忽略的。Ariane Briegel 是莱顿大学超微结构生物学教授，她认为这些在电子显微镜中观察到的结构事实上很可能是干燥过程中的人为污染，这也是为什么它们不能持续被观察到。
她表示：“我确实相信，在细胞之间存在物质交换，但是对于纳米管是否真实存在，我并不确信。”她补充说，缺乏可重复性只会更增加她的怀疑。
但是对于 Kost 来说，很多条件下都会产生纳米管，这便是证明它们真实存在的证据。“我发现，令我们备受鼓舞的是，有很多实验室都报道了非常非常相似的现象。”
事实上，纳米管这种显而易见的存在促使他继续向前。2019 年，她的团队发现，通过纳米管进行的氨基酸运输是单向的——细菌 A 产生的纳米管可以将物质从细菌 A 转移到细菌 B，但反过来则不行。这表明，纳米管具有控制作用，而不仅仅是连接两个细胞的细胞质的管道。
Kost 说，他的实验室正在进行的研究表明，纳米管可能不只是传递者，而且也是细菌协同作用的关键促进者。他说，在未发表的文献中，该实验室发现，纳米管的存在会让细胞选择相互协同而非竞争。“这完全改变了我看待生态学相互作用的方式。这一切看起来似乎在暗示，这些纳米管是协同进化的关键。”
同时，Ben-Yehuda 的团队也在继续揭露纳米管形成的细节。最近，研究人员发现，产生纳米管的细菌首先会向受体细胞发送水解酶的激活剂，这种激活剂可以诱使细胞壁重塑让纳米管洞穿，并通过其传送物质。
Ben-Yehuda 说，同时，细胞看起来也在以某种方式来为纳米管的排布提供导向。“它们可以在空间内的任何地方生长，但是它们总是直接朝着对方生长。这让我认为并非偶然。”
Pospíšil 在濒亡细胞生出的纳米管中并未观察到这种导向型，但是他观察到，纳米管在区域内的产生有着一定的倾向。在垂直伸长的枯草芽孢杆菌细胞中，Pospíšil 观察到，纳米管主要从细胞的两端（顶部和底部）产生，而不是从细胞的两侧产生。
开放科学中心的研究主管 Tim Errington 指出，出现相反的结果并不总是不好的。“在科学领域，存在不同的观点正是你想要的，因为你并非只需接受你所说的那些事情……你必须要不停地回顾它们。”
Ben-Yehuda 并未对 Pospíšil 的发现感到不安，并且对探索关于细菌纳米管的无数未解问题感到兴奋。“多年来，我们确信它们是真实存在的，尽管有些人认为它们并非如此。科学是一场马拉松，我们的研究就是跑一场马拉松，而非短跑。”
原文链接：
https://www.the-scientist.com/features/what-s-the-deal-with-bacterial-nanotubes-68780
作者｜Sruthi S. Balakrishnan
编译｜C。
审校｜617
编辑｜咲