抑病土壤的利用是保护植物免受土传病害侵染的有效策略。通过轮作和将植物残体翻入土壤，改变土壤的生物和理化性状，可以缓解土壤病原体胁迫。植物残体改良在多大程度上影响微生物群落知之甚少。近日，南京农业大学在《Microbiome》发表文章“Development of fungal-mediated soil suppressiveness against Fusarium wilt disease via plant residue manipulation”，报道了在香蕉枯萎病重病田中掺入菠萝渣如何改变土壤微生物组进而减轻病害发生的机制。

编者点评：该研究提供了一个利用具体的农业措施通过调控土壤微生物菌群诱导土壤免疫进行病害防治的成功范例。

土壤添加菠萝残体防治香蕉枯萎病模式图

背景

农业的可持续发展通过实施直接和/或间接调节土壤微生物组的管理来实现，以减少病原体引起的有害生物胁迫。如连续的单作周期导致土传病原体的逐渐积累，而特定的作物轮作系统可以改变土壤化学和生物特性来缓解病原体的压力。引起土传病害的几种病原体正日益威胁着全世界的农业生产，微生物介导的土壤抑制性展被认为是缓解这些影响的有效策略。从概念上讲，病原体数量、土壤微生物组多样性和结构是促进病害抑制或发病的主要因素。在这种情况下，土壤中关键有益微生物类群的出现已被证明可以通过直接抑制多种病原体来有效控制土传病害。这些有益微生物类群通过（i）抗菌或有毒物质的产生直接影响病原体的，（ii）对空间和资源的竞争，间接抑制病原体的生长，和/或（iii）通过生理和免疫系统代谢调节诱导植物保护反应。

越来越多的证据表明，特定的农业实践可以促进土壤抑制，例如使用有机材料或生物肥料，在土壤中加入植物残留物，以及作物轮作。这些策略主要依赖于促进有益微生物类群的出现和/或直接影响病原体种群，这两种策略都是有效控制病害的原因。作物轮作制度的使用有利于土壤养分的动态循环和土壤微生物组的时间变化，从而减轻土壤中病原体的积累。由于作物轮作，土壤中的植物残渣分解和根系分泌物会对病原体控制产生长期影响，这种现象被称为“遗留效应”，并通过改变物理化学性质来缓解土壤压力。因此，作物轮作和田间植物残体处理显然是土传疾病管理的重要策略。然而，这些策略受到的关注相对较少，因为人们大多致力于研究这些方法与土壤质量、养分循环和作物表现的整体方面的关系。因此，这些方法如何影响土壤微生物组的组成及其生态功能仍然不清楚。镰刀菌枯萎病严重危害香蕉产业，迫切需要制定有效的防治策略。

科学问题

植物残体掺入对微生物介导的土壤抑制性发展的影响：（1）在控制良好的条件下，将菠萝残渣加入土壤在多大程度上降低镰刀菌了FocTR4密度和香蕉枯萎病的发病率？（2）这些对FocTR4的负面影响是否与土壤生物或物理化学性质的变化有关？（3）是否存在与FocTR4疾病抑制相关的特定微生物类群？（4）与土壤中FocTR4抑制相关的微生物介导机制是什么？

研究方法

土壤取样和作物残留制备：有8年的香蕉单作栽培史，镰刀菌枯萎病严重，采集土壤进行两次温室试验。香蕉-菠萝轮作试验：在单一栽培和香蕉-菠萝轮作处理中收集健康的作物残留物，无菌去离子水清三次，将其分为地上和地下植物部分。BS，地上香蕉残渣；地下香蕉渣；PS，地上菠萝残渣；和PR，地下菠萝残渣。残渣被切成小块，磨成粉末，过4 mm筛网进行筛分，并测量总养分含量。

温室实验：300个聚丙烯罐（18cm×25cm，直径×高度），每个罐中填充5 kg充分混合的预取样土壤。除对照土壤无残渣（CK）外，还建立了五个处理：地上香蕉残渣（BS）、地下香蕉残渣（BR）、地上菠萝残渣（PS）、地下菠萝残渣（PR）。在香蕉幼苗移植之前，每个花盆补充100克相应的改良剂（即2%浓度）。这一数量与现场设置中残留物的掺入量一致。根据为每个残留物确定的养分可用性，将每个单独处理调整为等量的TN、TP和TK。每个重复包含10个单独的罐。每个盆栽中移植一株香蕉苗。

病害调查：1个月后调查镰刀菌枯萎病的发病率和严重度。在每个盆栽中，在实验结束时移除香蕉植株后，用无菌园艺铲在5–15厘米的深度收集土壤样本。每盆共收集50克土壤。对于每个重复，来自三个盆的土壤样本作为复合样本进行混合，每个块包含三个混合样本。每次处理共获得九个混合样品并进行处理。通过2 mm筛网筛分后，每个复合土样分为两部分。一部分储存在-80°C下用于后续DNA提取，另一部分储存在4°C下用于短期实验。采集的所有样品均进行物理化学分析，以确定土壤pH、电导率（EC）、有效磷（AP）、有效钾（AK）、总有机碳（TOC）、铵（NH4+）和硝酸盐（NO3−)。

微生物组分析：ITS1F/ITS2R引物扩增ITS的ITS1区域。

实验区FocTR4病原的分离与鉴定：进行镰刀菌分离和筛选。

FocTR4、A. fumigatus和F. solani定量：引物分别为FocSc-1/FocSc-2[52]、AfumiF1/AfumiR1和探针AfumiP1[53]、Fs-F/Fs-R和探针2。

拮抗类群的分离鉴定和FocTR4抑制实验：对真菌菌落分离、测定拮抗活性。

植物残渣提取物及其对FocTR4、A. fumigatus和F. solani生长的影响：将每种植物残渣粉末总计60 g（干重）添加到540 ml甲醇中，并在4°C下摇晃24小时。然后，使用0.22μm有机滤膜过滤所得溶液。使用旋转蒸发系统干燥过滤溶液，并将浓缩物质溶解在60 ml无菌去离子水中。灭菌后，向294 ml PDA培养基（即2%浓度，体积比：V/V）中添加6 ml源自每种植物残留物类型的溶液。接种病原菌。

FocTR4和拮抗真菌类群的代谢谱：Biolog FF微孔板™ （Biolog Company，USA）用于获得FocTR4的代谢谱，并将其与A. fumigatus和F. solani和其他三种镰刀菌的分离物进行比较，这三种镰刀菌在含有香蕉残留物的处理中的真菌分离期间大量出现，和另外三种已知对FocTR4没有拮抗作用的曲霉菌。每个真菌菌株在PDA培养基上培养以获得孢子。将每株菌株的0.1 ml孢子悬浮液（使用FF接种液中的浊度计，FF-IF调节至75%±2%）接种到Biolog FF微孔板中的每个孔中. 每次处理的三倍微孔板放置在20°C（即Westerdijk真菌生物多样性研究所培养物收集所建议的最佳生长温度）的有氧Omnilog培养箱读取器（美国Biolog公司）中。在12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、96小时、120小时、144小时和168小时测量590 nm处的比色值，并对对照孔进行封闭。只有在所有重复中观察到第一天和最后一天之间的差异时，结果才被视为阳性。每个菌株和FocTR4之间的共同碳源利用率通过（A）获得∩B） /B*100%，其中A为拮抗类群的有效碳源，B为FocTR4的有效碳源。

A. fumigatus和F. solani抑制病害的验证试验：在针对FocTR4的验证盆栽试验中，总共使用了三株F.solani（F.S-11、F.S-17和F.S-18）和三株A.fumigatus（A.F-7、A.F-12和A.F-15）。使用大肠杆菌培养物（EC）和无菌水处理（CKW）作为阴性对照。将微生物孢子或细胞接种到土壤中，最终浓度为104菌落形成单位（CFU）g−1块干土，每盆移植一株香蕉苗。45天后，从每个处理的6个盆中收集土壤样本，并通过qPCR（如上所述）测定FocTR4的丰度。整个实验重复两次，以测试结果的一致性和再现性。

结果

在香蕉枯萎病重病田中添加地上和地下菠萝残留物可显著减少土壤中的病原体数量，从而降低病害发生率。

植物残留物对镰刀菌枯萎病发生的影响

不同的作物残留对土壤真菌群落产生了显著影响，并且基于成对比较，所有处理彼此都显著不同，真菌群落对枯萎病的发生和抑制比细菌群落更为重要。

基于Bray-Curtis距离的土壤真菌群落主坐标分析（PCoA）

基于LDA分析，（F.solani）和OTU15（A.fumigant）是与疾病抑制最显著相关的前两个OTU。

LDA分析鉴定潜在真菌类群

土壤中潜在抑制真菌类群的定量分析和SEM分析：所有处理中的真菌分类群F.solani和A.fumigatus的绝对值（每克土壤的目标基因拷贝数）与FocTR4目标基因拷贝数的绝对量化值相结合，以使用结构方程建模（SEM）模拟疾病发生率。发现两种潜在的抑制类群对FocTR4拷贝数有直接的负面影响（ρ=− 0.51和ρ=− 分别为0.40）。FocTR4拷贝的绝对值与病害发生率有直接关系（ρ=0.84）。此外，这些分类群的目标基因拷贝数（绝对定量）与通过高通量测序获得的各自相对丰度之间存在显著相关性。