值得收藏！检测肺炎支原体最佳方法的分析与应用
作者：简川
一、肺炎支原体( Mycoplasma pneumoniae，MP) 是引起儿童时期肺炎或其他呼吸道感染的重要病原体之一。其中由MP为病原体所引起的最常见儿童疾病便是支原体肺炎（MycoPlasma Pneumoniae Pneumonia，MPP），占儿童肺炎的10%～20%，流行年份可达30%，且近几年其发病率呈逐年上升趋势。
MP 感染的肺炎与其他呼吸道感染或细菌、病毒感染的治疗方案与预防措施截然不同，并且MP感染具有起病隐匿、肺部体征轻、临床表现、影像学检查等常缺乏特异性等特点，给临床诊断与治疗带来了极大的困难！
因此，及时、有效地进行MP感染的检验与诊断，对指导临床治疗进而预防可能发生的医院内流行和并发症十分重要。
二、目前医院相关检验科室对肺炎支原体的检验主要采用如下4种方法，分别是：
1、PCR荧光探针法( PCR fluorescence probing) ；
2、被动凝集法( passive particle agglutination) ；
3、间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence，IFA)
4、MP分离培养法。
掌握这4种常用MP感染的检验方法，使用这些方法对疑似MP感染患儿进行检验与分析，最后便可以通过检验结果为临床诊断支原体感染做出重要参考与诊断依据。
三、PCR荧光探针法( PCR fluorescence probing) 、被动凝集法( passive particle agglutination) 、间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence，IFA)和MP分离培养法这4种常用检验肺炎支原体感染方法的介绍与优势、劣势分析。
1、PCR荧光探针法的基本原理介绍与优点、缺点分析
PCR荧光探针法是指：PCR扩增时，在加入一对扩增引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。荧光探针为一段线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（FAM或Hex等和一个荧光淬灭基团，当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR仪检测不到荧光信号；当PCR扩增时（在延伸阶段），Taq酶的 5' -3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。这就是PCR荧光探针法的原理。
优点主要集中于：1.检验人员可以利用不同探针，在一个体系中使用不同的荧光标记同时检测多种指标，可达到节省成本的目的。2.探针法比起其他检测方法来说还具有较高的特异性和准确性。3.由于PCR技术的不断进步，以标记特异性荧光探针为特点的荧光定量PCR技术不断成熟，完全闭管式操作已经逐渐普及，这样就大大减少了扩增产物污染的机会，使其同时具备良好的灵敏度和特异性，并可对扩增产物进行精确定量。
缺点是：PCR法多采用吸痰方式来采集标本，但是儿童咳痰能力较差、依从性也较差并且吸痰操作对医务人员要求高，因此此法只适用于症状较重有吸痰需要的住院患儿，而对于症状较轻暂时没有咳痰需求的患儿来说，此法就失去了使用价值。
2、被动凝集法的基本原理介绍与优点、缺点分析
被动凝集法指采用被动凝集反应（又称间接凝集反应）而产生的凝集现象叫被动凝集法。其主要原理是用表面吸附MP抗原的明胶颗粒吸附于某种免疫无关的、适当大小的微粒（载体微粒）表面，然后再与人血清中的MP抗体作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性的凝集现象。
优点为：1.操作简单快速（采静脉血清作为标本即可）、设备要求低、结果判读容易，过夜后再判读不发生显著变化。2.消除红细胞载体引起的非特异性凝集。3.特异性、灵敏性较高。4.血清MP抗体滴度与MP感染者病情的严重程度呈正相关。
缺点主要集中于：1.被动凝集法所采用的被动凝集反应仅用于检测MP抗体，而非直接检测肺炎支原体（MP），因此其阳性结果并不能确诊是MP感染。2.同时，其检测结果若呈阴性也并不代表患儿没有感染MP，只能说明此时没有产生MP抗体，因此会出现假阴性结果。
3、间接免疫荧光法(IFA)的基本原理介绍与优点、缺点分析
间接免疫荧光法(IFA)的原理:用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继续用间接荧光抗体即荧光二抗FITC，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物，在荧光显微镜下观察特异的荧光。简单点说就是将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。此法常用于细面、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
优点是：方法简便、特异性高，非特导性荧光染色少。
缺点是1、敏感性偏低。2、每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体，故其成本高且费时、费力。
4、MP分离培养法的基本原理介绍与优点、缺点分析
因为支原体常侵及人的粘膜表面，一般可用棉花拭子在患者粘膜表面涂抹取样后放入2~3ml支原体液体培养基的小管中，或取其分泌液，若标本是组织块，可在灭菌乳钵或玻璃匀浆后接种，取样后以最快的速度放入肺炎支原体培养基中培养。当3~4天后，培养基中长出长出典型菌落，呈"油煎蛋"状且边缘不整齐时，可判断此病原体为支原体。
优点时显而易见的：MP的分离培养和鉴定可客观反映MP感染的存在，作为传统的检测手段，至今仍是支原体鉴定的金标准。
缺点更是致命的：1.费时并且费力，MP对培养条件要求苛刻，生长缓慢，做出判定需3~4周。当标本中 MP 数量极少、培养基营养标准不够或操作不当时，均会出现假阴性结果。
四、通过正确、操作无失误的情况下，收集大量临床检验数据与治疗MP感染的支原体肺炎患儿的病程记录，直至治愈，并且在治疗过程中以MP分离培养法为佐证。
发现：494例受检患儿中，PCR荧光探针法阳性299例，阳性率60. 53%；被动凝集法阳性290例，阳性率58. 70% ; 间接免疫荧光法阳性242例，阳性率48. 99%。
注：1、被动凝集法将血清抗体滴度≥40作为血清学诊断标准。
2、未采用MP分离培养法参与比较的原因是：由于检验与判断时间太久，虽为支原体诊断金标准但其缺点更为致命，在短期确诊患儿“支原体感染”上和其他3种检验方法无比较意义。
五、因此可以看出PCR荧光探针法和被动凝集法在检验肺炎支原体感染上有一定优势。同时在这两种检验肺炎支原体感染的操作方法上也各有优劣，PCR荧光探针法所采取的样本为患儿痰液，而被动凝集法所采取的样本为患儿静脉血。比较采取痰液和静脉血这两种方法，一般采取患儿静脉血较易。
综上所述：
目前国内常见的 MP 感染检验方法包括培养法、血清学方法和PCR方法。由于培养法的局限性，临床并不常用，故临床应结合血清学和PCR方法的优缺点，联合用于临床诊断。若血清学检测阴性而PCR阳性，可能血清学检查时间过早，患者体内抗体尚未产生，甚至部分患者不能产生抗体; 当血清学方法阳性而PCR阴性时，须考虑近期是否已发生过支原体感染以及血清学检测假阳性的可能。
总之，这便给了检验科对可疑“肺炎支原体感染”的患儿做实验室辅助诊断时给出了思路：在诊断 MP感染时，可将被动凝集法作为MP感染的病原学筛查项目，将PCR方法作为补充，并结合临床症状和治疗效果综合判断，为临床医师争取在最短时间内做出相应诊疗措施治疗患者贡献出检验科的一份力量。
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