山东大学主创杂志首刊：利用两种工程菌的共培养系统偶联石化塑料PET的降解与生物可降解塑料PHB的生产...
近期，山东大学祁庆生团队在《Engineering Microbiology》杂志上发表了题为“Potential one-step strategy for PET degradation and PHB biosynthesis through co-cultivation of two engineered microorganisms”的研究论文。在该研究中，作者设计了一种PET降解与聚羟基丁酸酯（PHB）生产耦合的共培养系统（图1）。在该系统中，工程菌一（Yarrowia lipolytica）利用自身来源的脂酶信号肽功能性表达分泌Ideonalla sakaiensis来源的PET水解酶，对PET或者二聚体BHET进行水解，产生单体对苯二甲酸；工程菌二，即一株从PET废物样品中筛选出来的能够代谢对苯二甲酸的Pseudomonas stutzeri，通过重组表达Ralstonia eutropha来源的PHB合成基因簇（phbCAB），能够转化对苯二甲酸合成生物塑料PHB。通过共培养两株工程菌有望一步实现PET的降解和PHB的合成，达到PET塑料变废为宝的目的。
图1 PET降解与PHB生产耦合的共培养系统示意图
01
工程菌一，即表达分泌ISPETase的Y. lipolytica工程菌的构建
微生物无法直接吸收超大的聚合物分子，因此需要构建PET水解酶的表达分泌系统，在胞外将PET降解成小分子单体。Yarrowia lipolytica是一种研究广泛的“非常规”、二态型酵母，本身能够分泌多种酶，如蛋白酶、脂肪酶、酯酶和RNA酶，被用作研究蛋白质分泌的模型。作者将ISPETase基因通过实验室前期开发的非同源末端链接（NHEJ）技术整合至Yarrowia lipolytica基因组中进行表达。研究发现，BHET乳液被工程菌培养液上清催化反应后变澄清，而对照组无变化（图2A），说明工程菌成功分泌ISPETase并将BHET水解。为了进一步证明该结论，作者进行了BHET乳液催化产物的HPLC检测和胞外蛋白SDS电泳实验。结果显示，在工程菌培养液上清中检测到ISPETase大小的蛋白条带（图2B）；在催化体系中检测到BHET水解产物MHET和对苯二甲酸（图2C）。另外，将工程菌涂布BHET乳化平板进行培养，72小时后观察到透明圈产生。以上结果表明，Y. lipolytica是合适的ISPETase表达分泌宿主。为了进一步提高ISPETase的分泌水平，作者对信号肽进行了优化，发现使用Y. lipolytica自身来源的脂酶信号肽可以更多的分泌ISPETase，更快的水解BHET。在此基础上，通过随机整合，筛选高拷贝转化菌株，研究最终获得优化的ISPETase表达分泌工程菌。
图2 Yarrowia lipolytica表达分泌ISPETase的实验验证
02
工程菌二，即利用PET单体对苯二甲酸合成PHB的工程菌的构建
为了实现对PET水解产生的单体对苯二酸的生物转化，作者从PET废物样品中筛选出一株能够代谢对苯二甲酸的菌株P. stutzeri。但该菌株不能合成任何种类的聚羟基脂肪酸酯。经基因组测序和分析发现，P. stutzeri通过双加氧酶（tphA）和脱氢酶（tphB）两步催化转化对苯二甲酸生成原儿茶酸进行代谢；后者经3,4-双加氧酶催化开环，进入β-酮己二酸途径，最终产生乙酰辅酶A。而乙酰辅酶A是PHB合成的前体物质。作者通过引入R. eutropha来源的PHB合成基因簇（phbCAB），成功构建了能够转化对苯二甲酸合成PHB的P. stutzeri工程菌。该工程菌能够以10 g/L对苯二甲酸为唯一碳源进行生长并积累约11.56 wt%的PHB。
03
通过共培养两株工程菌一步法水解PET或者BHET合成PHB
为了实现PET降解和PHB合成的耦合，作者设计了两株工程菌的共培养系统。在该系统中，工程菌一利用葡萄糖为碳源生长并表达分泌PET水解酶，将培养基中的BHET或者PET水解，产生单体对苯二甲酸；工程菌二利用产生的对苯二甲酸进行生长并积累合成PHB。该系统在12小时内完全水解5.16 g/L的BHET（图3B），并在54小时内积累3.66 wt%的PHB（图3A）；该系统可以在228小时内水解PET产生0.31 g/L对苯二甲酸（图3D），但由于最终系统内对苯二甲酸的量较少以及工程菌二的PHB合成效率较低，未能实现PET到PHB的一步转化。尽管如此，本研究为人工菌群降解和回收PET废弃物提供了一种新的策略。
图3 共培养两株工程菌一步法水解PET或者BHET合成PHB
本研究获得中欧环境生物技术合作研究重大项目废弃塑料的生物降解的资金支持。中欧合作项目由国家自然科学基金委员会（National Natural Science Foundation of China, NSFC）与欧盟委员会（European Commission, EC）共同资助，旨在促使中欧科学家在“Microorganism communities for plastics biodegradation”领域开展实质性合作研究。该项目的目标是将易造成环境污染且难以降解的石化塑料，利用微生物菌群的代谢能力降解为单体小分子并为微生物所用，从而进一步实现高值生物化学品的生物合成。这不仅可以解决塑料污染问题，同时也将塑料垃圾“变废为宝”，创造更高的经济效益。
关于《Engineering Microbiology》
Engineering Microbiology是山东大学与爱思唯尔合作创办的开放获取期刊。Engineering Microbiology以提高微生物的应用价值为导向，重点关注工程微生物（古菌、细菌、真核微生物和病毒）在理论、机理、方法、技术和应用层面的创新和突出成果，以及改善微生物群体和微生物细胞及生化组分（例如酶和天然产物）的重大发现。同时，本刊也关注其他基于有潜在应用价值的微生物开展的基础微生物学领域重要的研究进展。2024年1月1日前投稿并发表文章，作者无需支付开放获取出版费用。诚邀您向Engineering Microbiology投稿！
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供稿：刘盼
编辑：徐娅 张彤 李晓萌
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