完全性基因敲除小鼠怎样鉴定？

基因工程小鼠基因型PCR鉴定的基本原则是利用基因工程小鼠基因组与野生型小鼠基因组的序列差异，以小鼠基因组DNA为模板进行PCR，并以凝胶电泳比对比不同基因型特异产物的大小，根据条带大小来区分小鼠的不同基因型。上期我们讲述了PCR胶浓度、电泳电压及时间的选择，今天我们就开始学习CRISPR/Cas9完全性基因敲除鼠的鉴定。

两条引物进行基因型鉴定

• 引物设计

将引物设计在敲除区域的两端，即F1和R1引物，通过条带大小判断基因型。

• 预期片段大小

条带1的大小为：F1/R1扩增的野生型片段减去敲除片段；

条带2的大小为：F1/R1扩增的野生型片段；

注：如果不精提基因组或不使用高保真高扩增效率的聚合酶，一般大于2kb的条带会较难扩增。图示中敲除区域大于2kb时，野生型扩增不出条带，即无条带2。

• 电泳结果

若电泳结果只有条带1，则判断为阳性纯合鼠（-/-）；

若电泳结果只有条带2，则判断为野生鼠（+/+）；

注：若条带2无法扩增，扩增出条带1只能判定为阳性鼠（杂合或者纯合）。

三条引物进行基因型鉴定

• 引物设计

若是所用的酶可以扩增出野生型的片段，用上文中的F1/R1这对引物就可以鉴定出纯杂合。但当敲除的片段过大，而所用的酶无法扩增出野生型的条带时，F/R这对引物是不能区分F2代的纯杂合，所以需要再设计一条位于敲除区域内的引物，使用3条引物用短片段体系即可判断基因型。

• 预期片段大小

条带1的大小为：F1/R1扩增的野生型片段减去敲除片段；

条带3的大小为：F1/R2扩增的野生型片段；

• 电泳结果

若电泳结果只有条带1，则判断为阳性纯合鼠（-/-）；

若电泳结果只有条带3，则判断为野生鼠（+/+）；

若电泳结果有条带1和条带3，则为阳性杂合鼠（+/-）。

注：以上实验可以3条引物放在一个体系中扩增，也可以分为2个体系进行扩增。目的扩增片段一般都小于1kb，使用短片段体系即可。另，如果两对引物预期片段大小相差仅几十bp，在有实验误差的情况下，同一胶图可能较难区分两条条带，建议分成2个体系进行扩增，先判断是否阳性，再进一步判断纯杂合。