活体成像技术应用之实验方法选择 / 开普饭

建立动物模型已经成为癌症、动脉粥样硬化、神经系统疾病（如阿尔茨海默氏病）和传染病研究中不可或缺的手段。这个过程中，很多情况下需要使用活体成像技术。

活体成像技术可用于观测特异性细胞、基因和分子的表达或相互作用关系；追踪靶细胞、药物；从分子和细胞水平对药物疗效进行成像；从病理水平评估疾病发展过程；并能够对同一个动物从时间、环境、发展和治疗效果等方面进行跟踪，使后期的基因治疗用于病人效果最优。

活体成像技术的实验方法主要包括生物发光(bioluminescence)和荧光(Fluorescence)两种技术：生物发光技术是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或者DNA，而荧光技术则是应用荧光蛋白(如GFP,RFP等)对细胞或者DNA进行标记。

活体成像技术主要有以下几个方面应用：

1.标记细胞，如癌症及药物研究、干细胞研究、细胞凋亡研究；

2. 标记DNA及RNA，特别是基因治疗方面的应用；

3. 标记基因，如转基因动物模型研究，基因表达研究；

4. 标记细菌，如研究蛋白质相互作用、代谢等。

活体成像仪器的组成及原理

生物光学成像仪器仅包含有限数量的基本组件：灵敏的CCD摄像头，用于荧光成像的滤光器系统和照明设备，与计算机控制的载物台组合的微距镜头，不透光的成像室以及用于成像和控制的软件设备，详细见下图：

使用生物光学成像最重要优势是成像过程的非破坏性和非侵入性。活体成像可以重复进行感染过程的监控，克服了动物与动物之间变异的问题。

在使用活体成像技术需要考虑如下三个方面：

1. 环境条件对生物发光和荧光产量的影响；

2. 生物光学成像的空间分辨率和光敏性；

3. 生物材料相关感染的定量和定位。

两种技术：生物发光和荧光

生物发光(bioluminescence)和荧光(Fluorescence)两种技术都可以用来做活体成像研究。使用荧光成像技术如GFP荧光蛋白，其在体内对肿瘤的生长进行成像具有许多重要优势。与荧光素酶报道基因相比，GFP具有更强的信号，动物可以不受限制约束即可进行成像观察。

使用荧光蛋白如GFP，只需用相当简单的设备进行观察及捕获成像照片，并且不需要完全黑暗的环境。GFP的荧光强度很强，并且GFP的蛋白质序列也已被“人源化”，能够在哺乳动物细胞中高度表达。与荧光素酶不同，荧光蛋白具有多种颜色，可以对多个事件进行成像。此外，GFP荧光相对不受外部环境的影响，因为发色团受蛋白质的三维结构保护。标记有GFP绿色荧光蛋白的细胞已用于追踪活啮齿动物的转移和血管生成，GFP绿色荧光蛋白表达细菌已用于研究小鼠中空间迁移和感染过程的行为。

裸鼠GFP和RFP标记肿瘤的全身和开放式成像

图片来自Nat Protoc. 2006;1(3):1429-38

说到这里，是不是觉得使用荧光蛋白进行活体成像更有优势呢？

使用生物发光技术进行活体成像研究，是一种活体生物的光生化反应，是自然现象，和荧光蛋白相比，不需要光照激发就能观察到。生物发光技术如使用Firefly luciferase蛋白用作肿瘤细胞生长和转移的报告基因，目前还没有关于重复使用底物导致毒性的报道。生物发光技术特异性强，无自发荧光，灵敏度高，在体内可以检测到几百个细胞，检测深度在3-4cm，可以精确定量。

DMSO和amlexanox治疗组的生物发光图像的定量分析

图片来自Cell Death Dis. 2017 Aug 31;8(8):e3022. doi: 10.1038/cddis.2017.396

图片中使用的慢病毒由上海吉凯基因提供，载体为GV260(Ubi-firefly_Luciferase-IRES-Puromycin)

虽然荧光信号远远强于生物发光，但是非特异性荧光产生的背景噪音使其信噪比远远低于生物发光。二者的优缺点见下表，对于不同的研究，可以根据二者的特点和具体的实验方案选择合适的方法。

参数	GFP/RFP	Luciferase
信号强度	6.6*10⁹ s^-1 cm^-2 steradian^-1	7.4*10⁶ s^-1 cm^-2 steradian^-1
体外成像最少细胞数	1	300
体内成像最少细胞数	1	3000
是否需要底物	不需要	需要
是否需要麻醉	不需要麻醉	需要麻醉
是否可以多荧光标记	荧光选择多	不可以
信号稳定性	稳定	不可以
是否需要及发光	需要	不需要