Cell Metabolism：巨噬细胞外泌体促进胰岛素敏感性
背景介绍
胰岛素抵抗是糖尿病的主要病理特性，而肥胖是人类胰岛素抵抗的主要驱动因素，由肥胖引起的慢性组织炎症可以导致胰岛素抵抗，特别是当炎症发生在脂肪组织和肝脏的情况下。提及炎症，不得不说起机体的免疫系统，巨噬细胞是免疫系统的一员大将，不仅可以抵外敌（病原体的侵入），还可以排内患（修复感染或者受损的组织），因此巨噬细胞对于维持机体健康是至关重要的。机体在健康状态下，关键代谢组织（如脂肪组织、肝脏和骨骼肌）中的巨噬细胞会优先表现出替代活化的、抗炎的M2样表型。其中，嗜酸性粒细胞、调节性T细胞和脂肪细胞分泌的IL4（白细胞介素4）和IL13（白细胞介素13）是诱导巨噬细胞向M2样极化的重要因素。
M2巨噬细胞能够调节组织重塑和炎症消退，进而在维持系统性胰岛素敏感性和葡萄糖稳态方面发挥关键作用。先前研究表明，M2样巨噬细胞的数量的减少会加剧肥胖引起的葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗[1]。肥胖会改变组织微环境，如趋化因子的分泌增加和游离脂肪酸的水平升高等，这些因素都能促使巨噬细胞转变为促炎的M1型的激活状态。因此，在肥胖的背景下，提高M2样巨噬细胞的功能有望改善肥胖的病理表现。
近年来，脂肪组织微环境的研究热点由细胞因子逐渐转移到对代谢稳态发挥重要作用的外泌体。本文作者之前的研究证实了肥胖小鼠ATMs（脂肪组织巨噬细胞）分泌的外泌体具有胰岛素抵抗作用，并且此状态下小鼠ATMs大多数是促炎的M1巨噬细胞。因此，作者假设M2巨噬细胞分泌的外泌体（M2 Exos）可以提高胰岛素敏感性。基于此假说，作者构建了M2巨噬细胞激活的细胞模型（看官好奇怎么构建的？莫急，且待正文娓娓叙来），并收集了M2 Exos。结果发现，M2 Exos确实能够提高胰岛素敏感性。同时，外泌体中miRNA的耗竭则阻断了M2 Exos的“胰岛素增敏”能力，说明外泌体中miRNA与胰岛素敏感性相关。作者进一步研究发现miR-690在M2 Exos中高表达，并在体内和体外作为胰岛素增敏剂发挥作用。Nadk是miR-690的靶向mRNA之一，在调节巨噬细胞炎症和胰岛素信号转导中发挥作用。综上所述，本文表明miR-690可作为一种新的治疗性胰岛素增敏剂，在治疗肥胖及相关代谢性疾病方面发挥一定作用。
1、M2巨噬细胞来源的外泌体（M2 Exos）可改善胰岛素抵抗
2、M2 Exos中的miRNA发挥胰岛素增敏作用
3、miR-690是M2 Exos内形成胰岛素增敏效应的miRNA
4、miR-690-Nadk轴调节炎症反应和胰岛素信号
研究结果
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抗炎巨噬细胞来源的细胞外泌体可以减轻肥胖诱导的胰岛素抵抗
作者之前的研究表明，将瘦小鼠eWAT （附睾白色脂肪组织）中M2型ATM分泌的外泌体通过尾静脉注射的方式给予肥胖小鼠，可以提高肥胖小鼠的胰岛素敏感性。然而，由于瘦小鼠中的ATM相对较少，每处理1只肥胖小鼠需要收集20-25只瘦小鼠的外泌体，因此难以进行更深入的机制研究。为了克服这个难题，作者用IL4/IL13处理小鼠BMDMs（骨髓来源的巨噬细胞），在体外诱导BMDMs形成抗炎的M2巨噬细胞。接下来，作者提取了M2巨噬细胞分泌的外泌体（M2 Exos），并通过电镜、分子粒径和WB等技术进行了外泌体质量检测（图 S1A-S1C）。此外，作者通过尾静脉注射将PKH26标记的M2 Exos对肥胖小鼠进行体内给药，并检测给药后M2 Exos的体内分布情况，发现这些外泌体主要被肝脏、骨骼肌和脂肪组织吸收（图 S1D）。
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简而言之，取材6-8周的小鼠的股骨和胫骨，使用包含2% FBS的PBS冲洗分离得到骨髓细胞，进一步使用NH4Cl溶液裂解红细胞后，即可获得BMDMs，培养7天后达到成熟状态。为了诱导巨噬细胞极化，可以使用LPS或LPS+IFNγ刺激诱导形成M1巨噬细胞，或使用IL-4和/或IL-13刺激诱导形成M2巨噬细胞。巨噬细胞诱导极化的效果可以根据细胞形态、表面标记物、细胞因子产生以及细胞信号通路激活的变化等进行评估。
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外泌体包含多种内容物，包括miRNA、脂质和蛋白质等（想要了解更多的外泌体知识，请迈入传送门：外泌体第一弹/第二弹/第三弹）。为了研究M2 Exos中的miRNAs对上述表型的影响，作者构建了一个髓细胞特异性Dicer敲除（Dicer KO）的小鼠模型，Dicer是一种核酸内切酶，对于miRNA的生物学发生至关重要。不言而喻，Dicer KO小鼠的BMDMs中无法产生miRNA，其分泌的M2 Exos自然也无法装配miRNA。作者通过检测Dicer敲除前后M2 Exos中的miR-223的水平，证实了Dicer KO小鼠分泌的M2 Exos中不包含miRNA（注：miR-223是髓细胞特异性的miRNA，本文的M2巨噬细胞是髓细胞诱导分化而成，故M2 Exos中一定包含miR-233。此处的miR-223可理解为M2 Exos的miRNA内参）（图 S3A-B）。
作者接下来收集了M2 Exos（野生型小鼠的M2 Exos）和Dicer KO M2 Exos（Dicer KO小鼠的M2 Exos）来处理3T3-L1脂肪细胞和L6肌细胞。结果发现，Dicer KO M2 Exos处理组胰岛素刺激的葡萄糖摄取能力减弱（图 3A-B）。作者还评估了两种外泌体对HFD（高脂饮食）饲养小鼠的影响，发现M2 Exos处理能显著增强胰岛素敏感性和葡萄糖耐量，而Dicer KO M2 Exos处理组小鼠则没有显著变化（图 3C-D）。这些数据表明，miRNAs是M2 Exos增强胰岛素敏感性的关键成分。
图3：miRNA是M2 Exos发挥效应的关键成分
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M2 Exos中的miR-690可改善胰岛素敏感性
考虑到miRNA在M2 Exos中的关键作用，作者接下来对其开展了一系列的机制探索。之前的研究已经建立了M2-ATM-Exos（M2型脂肪组织巨噬细胞分泌的外泌体）的miRNA图谱[3]，因此，作者在3T3-L1脂肪细胞中进行葡萄糖转运实验，检测M2 Exos中丰度较高的5个miRNA对胰岛素刺激的葡萄糖摄取的影响，排除了4个无显著影响的miRNA（图 S4A），并对miR-690展开进一步评估。研究发现，瘦小鼠分泌的M2 Exos中miR-690的丰度比肥胖小鼠的更高（图 S4B）。同时，M2 Exos中miR-690的丰度比M1和M0巨噬细胞（即未分化的巨噬细胞）的更高（图 S4C-D），甚至M2 Exos中的miR-690的丰度几乎与M2-ATM-Exos中的一致（图 S4B）。此外，作者还发现将M2 Exos注射肥胖小鼠后，其关键代谢组织中miR-690丰度变高（图 S4E）。
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M1巨噬细胞是可以产生促炎细胞因子的巨噬细胞，被称为经典型巨噬细胞。M1巨噬细胞的特征在于分泌细胞因子（如IL-1β、TNF、IL-12和IL-18）的能力强。M1巨噬细胞中，主要组织相容性复合体II类（MHC-II）、CD68和CD80、CD86共刺激分子高表达。当接受如下刺激时，可发生经典的巨噬细胞激活：（1）IFN-γ，主要由其他细胞类型（TH1细胞、细胞毒性T细胞和NK细胞）分泌; （2）脂多糖（LPS），革兰氏阴性细菌外膜的组分;
（3）粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），刺激产生促炎细胞因子。M1巨噬细胞具有吞噬大量病原体的能力，并能杀死细菌。然而，在特定条件下，M1巨噬细胞加剧了对健康有害的炎症反应。此外，值得注意的是，肥胖能促进巨噬细胞的极化从M2型向M1型转变。
M2巨噬细胞又称替代性活化巨噬细胞。已发现一些刺激因素如CSF-1、IL-4、IL-10、TGF-β和IL-13、真菌和蠕虫感染，这些因素有利于M2亚群分化。在组织重塑、血管生成和过敏性疾病中，M2巨噬细胞起着核心作用。M2巨噬细胞的特征在于表达巨噬细胞甘露糖受体（MMR），即CD206。但是单纯检测CD206的表达不能确认M2巨噬细胞，需配合其他标志物（如CMAF）联合确认。有研究表明，M2巨噬细胞能够修复组织损伤。
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Nadk是miR-690的靶基因，调控胰岛素信号转导
miRNAs通过与靶mRNA进行碱基互补配对阻断翻译和/或诱导靶mRNA降解来发挥其生物学作用。作者利用TargetScan Mouse 7.2软件预测了miR-690靶基因，并开展了实验验证。结果发现Nadk基因表达在miR-690过表达的3T3-L1脂肪细胞、L6肌细胞、肝原代细胞中均受到显著抑制（图 7A）。此外，含有miR-690 mimic的肥胖小鼠的肝脏、骨骼肌和脂肪组织中，Nadk的表达均显著降低（图 S7A-C）。转染miR-690 mimic后，人源HepG2肝细胞系中NADK的表达也降低（图 S7D）。荧光素酶报告基因实验也证明了Nadk是miR-690的靶mRNA（图 7B）。
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NADK（NAD激酶）能催化磷酸基团从ATP转移到NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）生成NADP+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐），然后再通过脱氢酶（如6-磷酸葡萄糖脱氢酶和苹果酸酶）将NADP+还原为NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）。NADPH提供生物合成反应和氧化-还原所需的还原当量，在多种代谢和生物合成途径中起着重要的辅助因子的作用。比如，NADPH参与脂质和胆固醇合成过程。
讨论
1. 首先，文章讨论部分提及，有研究表明，肥胖可以通过抑制NAD+的生物合成，提示用NAD+中间体治疗可以提高胰岛素敏感性；
2. Nadk能催化磷酸基团从ATP转移到NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）生成NADP+；所以，Nadk减少，可以增加NAD+的量；
3. M2 Exos中的miR-690可以改善肥胖小鼠的胰岛素敏感性 ；
4. Nadk是miR-690的靶基因；
总的来说，M2 Exos中的miR-690通过靶向Nadk，并抑制Nadk的表达，进而增加NAD+的水平，最终提高胰岛素敏感性。
总结
总之，本篇文章揭示了M2 Exos来源的miR-690对肥胖小鼠胰岛素敏感性的改善作用。M2 Exos由M2极化的巨噬细胞分泌，其中，M2巨噬细胞由IL4/IL13诱导BMDMs分化而成。在M2 Exos中，miR-690是发挥胰岛素增敏作用的主要效应分子。Nadk是miR-690在胞内的靶mRNA，miR-690-Nadk轴可以调控胰岛素信号通路。该研究成果有望应用于肥胖及相关代谢性疾病的治疗。
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