科研 | MOL METAB：前阿黑皮素原神经元Sirt6 通过调控瘦素信号转导影响机体能量代谢(国人佳作)
编译：洛雪，编辑：谢衣、江舜尧。
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目的：Sirt6 在多种组织能量代谢中具有重要的调控作用。但是，下丘脑前阿黑皮素原 (POMC)神经元中的Sirt6是如何调节机体能量平衡机制尚不清楚。本文旨在阐明下丘脑POMC神经元Sirt6在调节能量平衡中发挥的作用及其机制。
方法：构建Sirt6过表达体系，通过立体定位仪向从饮食诱导的肥胖小鼠的双侧下丘脑弓形核（ARC）注射腺病毒。构建Sirt6敲除体系，建立Sirt6基因在POMC神经元细胞中的敲除小鼠模型（PKO小鼠）。用低脂饮食或高脂饮食喂养小鼠，并监测小鼠体重和食物摄入。评估小鼠体脂分布参数和糖脂代谢指标。
结果：小鼠ARC中过表达Sirt6可改善饮食引起的肥胖。而在小鼠POMC神经元中敲除Sirt6可使小鼠易发生肥胖和代谢紊乱，PKO小鼠摄入的脂肪量和食物量均增加，而能量消耗减少。从机制上讲，下丘脑POMC神经元中Sirt6可以调节瘦素信号传导，而Sirt6的缺失会影响瘦素介导的信号转导和转录活化因子3（STAT3）的磷酸化，也会影响瘦素对减轻体重和减少摄食量的作用以及脂肪分解效果。此外，抑制Sirt6可减弱瘦素引发的POMC神经元的去极化作用。
结论：POMCMolecular Metabolism神经元sirt6在改善能量失衡中发挥关键作用，这提示了POMC神经元sirt6是改善能量负平衡的重要调节因子。
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实验设计
构建下丘脑POMC神经元Sirt6基因过表达和敲除体系。构建Sirt6过表达体系，通过立体定位仪向从饮食诱导的肥胖小鼠的双侧下丘脑弓形核（ARC）注射腺病毒。构建Sirt6敲除体系，建立Sirt6基因在POMC神经元细胞中的敲除小鼠模型（PKO小鼠）。
实验组PKO小鼠：将Sirt6 loxP / loxP小鼠（LoxP小鼠）与POMC启动子控制下表达Cre重组酶的小鼠交配，获得sirt6 POMC神经元特异性敲除小鼠，简称PKO小鼠
对照组loxP小鼠：Sirt6 loxP / loxP小鼠，简称loxP小鼠，用作PKO小鼠对照。
所有试验小鼠背景均为雄性C57BL/6J小鼠，用低脂饮食CD或高脂饮食HFD喂养小鼠12-16周，并监测小鼠体重和食物摄入，评估小鼠体脂分布参数和糖脂代谢指标。
实验结果
1． ARC中过表达Sirt6可改善饮食引起的肥胖
为了评估下丘脑Sirt6基因的潜在作用，作者首先评估了其在不同营养状态下的Sirt6的mRNA及其蛋白表达情况。与自由进食的对照组LoxP小鼠相比，禁食组的小鼠下丘脑SIRT6的mRNA和蛋白的表达水平均显著降低（图1A-1B）。与正常喂养的对照组LoxP相比， HFD肥胖小鼠模型组和db / db糖尿病小鼠模型组下丘脑中Sirt6的mRNA和蛋白表达也显著降低（图1C-1F）。
接下来，作者将Ad-GFP或Ad-Sirt6立体定位注射到HFD肥胖小鼠的ARC（图1G），并评估Sirt6对代谢功能的影响。在显微镜下观察，腺病毒在ARC中成功递送（图1H），且通过Western blot分析证实了Sirt6的过表达（补充图1A）。体重记录显示，ARC中过表达Sirt6显著降低了体重（图1I）。皮下白色脂肪(i WAT)和附睾白色脂肪(eWAT)的重量也减少了（图1J）。此外，与对照组LoxP相比，注射Ad-Sirt6的小鼠的每日食物摄入量显著降低（图1K），并且在iWAT中Cox8b的表达上调（图1L）。这些变化与下丘脑POMC神经元的mRNA水平升高有关（图1M）。总之，这些结果表明下丘脑Sirt6在调节全身能量平衡中发挥关键作用。
POMC神经元在能量代谢中有着关键作用。接下来，作者通过双重免疫荧光染色法检测了下丘脑POMC神经元中Sirt6的表达。与正常饮食的对照组LoxP相比，禁食组、HFD肥胖小鼠模型组和db / db糖尿病小鼠模型组的POMC神经元中Sirt6的表达水平显著降低（图1N-1O）。通过对tdTomato标记的下丘脑POMC神经元的FACS分选，发现了HFD肥胖小鼠模型组中下丘脑POMC神经元的Sirt6水平明显低于对照组LoxP对照（图1P）。这些结果都进一步表明POMC神经元中的Sirt6在调节能量稳态过程中起关键作用。
图1 ARC中过表达Sirt6可改善饮食引起的肥胖。
（A，B）qPCR和Western blot分析自由进食组（n = 9）或禁食组（n = 8）小鼠的下丘脑Sirt6表达情况; （C，D）qPCR和Western blot分析正常饮食CD组（n = 8）或高脂饮食HFD组（n = 8）小鼠的下丘脑Sirt6表达情况; （E，F）qPCR和Western blot分析db / m对照组（n = 7）或db / db糖尿病小鼠组（n = 7）小鼠的下丘脑Sirt6表达情况；（G）Ad-GFP或Ad-Sirt6立体定位注射到小鼠双侧ARC示意图；（H）小鼠ARC中Ad-GFP（绿色）的定位，比例尺，50 µm；（I，J）腺病毒注射后7天小鼠的体重情况，脂肪组织和肝脏重量；（K）注射Ad-GFP或Ad-Sirt6后的每日食物摄入量（n = 5）；（L）qPCR分析i-WAT中注射Ad-GFP或Ad-Sirt6（n = 6）的小鼠的褐变相关基因的mRNA水平；（M）注射Ad-GFP或Ad-Sirt6的小鼠的下丘脑提取物中的POMC mRNA水平（n=5）。（N,O）正常饮食CD组（n = 15），禁食24 h组（n = 17），HFD（正常饮食）组，db / db糖尿病模型组小鼠ARC POMC神经元（红色）中Sirt6（绿色）的Sirt6（绿色）的免疫荧光染色的代表性图像和定量统计，比例尺，50 µm；（P）捕获在正常饮食CD（n = 5）或高脂饮食HFD（n = 4）条件下小鼠的ARC中的POMC -tdTomato细胞，用于Sirt6的qPCR分析。数据表示均数±平均标准误差（SEM）。 * p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。
2. 成功构建Sirt6 POMC神经元细胞特异性敲除小鼠模型
为了研究POMC神经元中Sirt6基因的作用，作者将Sirt6 loxP / loxP小鼠（LoxP小鼠）与POMC启动子控制下表达Cre重组酶的小鼠交配，获得sirt6 POMC神经元特异性敲除小鼠（PKO小鼠）（图2A）。PCR基因型鉴定结果表明Cre重组酶在下丘脑中的特异性表达(补充图2A)，SIRT6的mRNA表达水平在ARC中明显低于对照组LoxP，但小鼠脑部其他区域中SIRT6的mRNA表达水平与对照组LoxP无明显差别(图2B)。
3. POMC神经元SIRT6缺失诱发肥胖表型
在相同正常饮食或HFD高脂饮食条件下， PKO小鼠的平均体重明显比LoxP小鼠高（图2C）。饲喂HFD的PKO小鼠体重高是由于皮下白色脂肪(i WAT)、附睾白色脂肪(eWAT) 和棕色脂肪(BAT)重量的增加导致的（图2D-2F）。HE染色表明，在相同正常饮食或HFD高脂饮食条件下，PKO小鼠皮下白色脂肪(i WAT)、附睾白色脂肪(eWAT) 和棕色脂肪(BAT)中的脂肪细胞均增大，推测PKO小鼠中皮下白色脂肪(i WAT)、附睾白色脂肪(eWAT) 重量较高，是由脂肪细胞增大而引起的（图2G）。细胞大小的定量统计也进一步确证了HE染色结果（图2H）。总之，在相同正常饮食或HFD高脂饮食条件下，POMC神经元中的Sirt6基因在抵抗肥胖中发挥重要作用。
4．SIRT6基因敲除小鼠（PKO小鼠）能量平衡紊乱
能量稳态通过能量摄入和能量消耗之间的动态平衡而得以维持。为了确定SIRT6基因敲除引发肥胖的潜在机制，作者还评估了小鼠食物摄入量，能量消耗和运动能力。无论在正常饮食，HFD高脂饮食条件下（图3A），还是在禁食过夜后（图3B），与对照组LoxP相比，SIRT6基因敲除小鼠（PKO小鼠）食物摄入量均明显增加，O2的消耗和CO 2产生，释放的热量均显著降低（图3C-3D，补充图5A），而身体活动量无明显没有变化（补充图5B）。说明SIRT6基因敲除小鼠（PKO小鼠）中较高的体重也与能量消耗的减少有关。
在急性冷暴露后，在正常饮食或HFD高脂饮食条件下，PKO小鼠的直肠温度迅速下降（图3E，补充图5C）。能量消耗的减少和PKO小鼠对寒冷的适应能力降低可能是由于BAT的产热能力降低或iWAT褐变。检测对照组LoxP和PKO小鼠的棕色脂肪(BAT)中UCP1的mRNA和蛋白表达，无明显差异（补充图5D-5F），因此BAT的产热可能不能解释体温下降的原因。检测对照组LoxP和PKO小鼠的皮下白色脂肪(i WAT)中Ucp1的mRNA和蛋白表达，发现PKO小鼠中Ucp1的mRNA和蛋白水平被显著抑制（图3F-3H）。
利用18氟-脱氧葡萄糖（18 F-FDG）PET/CT显像检测小鼠的皮下白色脂肪(i WAT)活动状态，脂肪在被激活产热过程中，会引起18氟-脱氧葡萄糖（18 F-FDG）的摄取增多，造成PET影像变化。PET / CT实验结果表明，与对照组LoxP相比，PKO小鼠的皮下白色脂肪(i WAT)中的18 F-FDG摄取减少（图3I-3K），说明皮下白色脂肪(i WAT)产热减少。这些结果表明， SIRT6基因敲除引发的肥胖表型是由食欲亢进和能量消耗减少引起的。
脂肪分解是产热必不可少的一环，因为脂肪动员时，脂类水解释放的脂肪酸是UCP1的激活剂，又是产热呼吸的底物。与预期结果一致，在HFD高脂饮食条件下，PKO小鼠的eWAT和iWAT中甘油水解释放速率均降低（图3L-3M），此外，脂解过程中的关键成分如p-HSL，脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）和p-Plin1也显著被抑制（图3N-3O）。
交感神经系统（SNS）在脂肪组织的脂解活性和褐变中发挥关键作用。为了确定iWAT中褐变和脂解的减少是否与SNS功能改变有关，作者评估了iWAT中交感神经支配和SNS释放的去甲肾上腺素（NE）水平，发现酪氨酸羟化酶（TH）（一种儿茶酚胺）以及ADRB3（一种NE受体）的表达水平在PKO小鼠的iWAT中显著降低（图3P）。同样地，PKO小鼠iWAT中的NE水平也大大降低（图3Q）。以上结果表明，敲除POMC神经元Sirt6通过影响小鼠能量摄入量的增多和能量消耗的减少促进了小鼠体重的增加。
5. POMC神经元的Sirt6缺失影响下丘脑POMC表达和瘦素功能
为了进一步研究PKO小鼠食欲亢进和能量消耗减少的机制，作者检测了下丘脑中的神经肽基因POMC，Cart，Agrp和Npy的表达量，已知这些基因在调节食物摄入和能量消耗过程中起关键作用。HFD高脂饮食条件下，PKO小鼠和对照组LoxP小鼠Cart，Agrp和Npy的mRNA水平无明显差异，PKO小鼠中POMC的mRNA水平与对照组LoxP相比显著下调（图4A）。POMC免疫荧光染色和免疫印迹检测表明，下丘脑POMC蛋白表达水平降低（图4B-4C和补充图6A）。
瘦素具有广泛的生物学作用，瘦素作用于下丘脑神经元，调节下丘脑神经元的抑制和激活，导致负能量平衡。因此，作者推测PKO小鼠中POMC的mRNA和蛋白表达水平的下降可能是由瘦素的生物学功能异常引起的。作者检测了对照组LoxP小鼠和PKO小鼠下丘脑中瘦素信号通路中的关键基因的mRNA表达水平变化，并发现PKO小鼠中Jak2和Pi3k的mRNA水平显著下调（图4D）。瘦素在减轻体重和摄食量方面的作用明显， 6周龄的对照组LoxP小鼠比PKO小鼠在瘦素减轻体重和摄食量方面的作用更明显，具有显著性差异 (图4E-4F)。
瘦素通过交感神经与脂肪组织互作驱动WAT脂肪分解。在PKO小鼠中，eWAT和iWAT中关键脂解蛋白的磷酸化水平较低（图4G-4H）。STAT3的磷酸化对瘦素信号传导是不可或缺的，PKO小鼠中STAT3的磷酸化水平 (Tyr705磷酸化)降低，引起瘦素信号传导障碍（图4I-4J）。这些数据表明，POMC神经元中的Sirt6是维持瘦素的正常功能不可或缺的。
6. Sirt6的缺失减弱了瘦素引发的POMC神经元去极化作用
为了进一步研究PKO小鼠中瘦素功能异常的机制，作者使用Cre/tdTomato小鼠对POMC神经元进行了遗传标记小鼠（图5A），并研究了瘦素对小鼠脑切片中POMC神经元活性的影响。电生理记录显示，Sirt6抑制剂OSS_128167几乎不影响POMC神经元的静息膜电位（图5B-5D）。而瘦素刺激后，POMC神经元迅速去极化，膜电位增加（图5E-5G）。但这种去极化因为Sirt6的缺失而被极大地减弱了（图5E-5G）。这些结果进一步证明了，POMC神经元中的Sirt6是维持瘦素的正常功能不可或缺的。
图5 Sirt6的缺失减弱了瘦素引发的POMC神经元去极化激活
。 （A）箭头处指示POMC神经元，图像表明tdTomato和Alexa Fluor 350的共定位；（B-D）有无OSS_128167（100 µM）处理的POMC神经元的电生理记录（n = 10）；（E-G）加入瘦素后，有无OSS_128167（100 µM）（n = 7）的POMC神经元去极化的电生理记录。数据表示均数±平均标准误差（SEM）。* p ＜0.05。
7.POMC神经元中Sirt6的缺失影响体内葡萄糖稳态并促进肝脏脂肪变性
在HFD高脂饮食条件下，PKO小鼠的糖耐受(GTT)和胰岛素耐受(ITT)均较差（图6A-6B）。但与对照组LoxP小鼠相比，PKO小鼠的血清脂联素水平无明显差异，但胰岛素水平却显著增加（图6C）。PKO小鼠肝脏和骨骼肌中AKT磷酸化水平降低（图6E），说明肝脏脂肪变性与肥胖和胰岛素抵抗有关。
在HFD高脂饮食条件下，肉眼可见PKO小鼠肝脏中的脂质蓄积显著多于对照组LoxP小鼠。H＆E染色和油红O染色也表明，PKO小鼠肝脏中的脂质蓄积显著多于对照组LoxP小鼠，且PKO小鼠肝脏重量更重（图6F-6G）。此外，肝组织脂质定量表明， PKO小鼠肝脏中血清总胆固醇 TC 或甘油三酯 TG 水平较高（图6H-6I），PKO小鼠的肝脏中Srebp1c，Fas和Acc脂质合成基因上调（图6J）。以上结果表明，POMC神经元中Sirt6的缺失影响体内葡萄糖稳态并促进肝脏脂肪变性。
图6在HFD高脂饮食条件下，POMC神经元中Sirt6的缺失影响体内葡萄糖稳态并促进肝脏脂肪变性。
（A）20周龄的LoxP（n = 8）和PKO（n = 7）小鼠的糖耐受GTT实验；（B）LoxP（n = 12）和PKO（n = 11）小鼠的胰岛素耐受ITT实验；（C，D）喂食HFD小鼠， LoxP（n = 8）和PKO（n = 6）小鼠通宵禁食后的血清胰岛素水平和血清脂联素水平；（E）蛋白质印迹分析。注射胰岛素（1 U / kg）15分钟后，肝脏，脂肪组织和骨骼肌中AKT和p-AKT（Ser473）的表达情况；（F）20周龄LoxP和PKO小鼠的H＆E和油红O染色代表图，比例尺，100 µm；（G）20周龄LoxP（n = 8）和PKO（n = 16）小鼠的肝脏重量；（H，I）20周龄LoxP（n = 11）和PKO（n = 18）小鼠的肝甘油三酯 TG和血清总胆固醇 TC 水平；（J）qPCR检测LoxP（n = 7）和PKO（n = 9）小鼠的肝脏中脂肪合成基因的mRNA水平。数据表示均数±平均标准误差（SEM）。 * p ＜0.05，** p ＜0.01，*** p ＜0.001。
8.POMC神经元特异性SIRT6敲除导致脂肪组织炎症水平增加
肥胖可能与脂肪组织中的炎症水平增加有关。通过对Perilipin1（脂肪细胞标志物）和F4 / 80（巨噬细胞标记物）双重免疫荧光染色，发现在HFD高脂饮食条件下，PKO小鼠中F4 / 80+细胞数显著高于对照组（图7A）。在PKO小鼠中的Mcp-1，Tnf-α，II-1β和II-6炎症因子的基因表达水平均被上调（图7B）。另外，PKO小鼠eWAT中F4 / 80，Cd68，Cd11b，Cd11c和Cxcl2等巨噬细胞相关基因表达水平也被上调（图7C）。然而，检测对照组LoxP和PKO小鼠中抗炎细胞因子Arg1的mRNA表达，无明显差异（图7C）。流式细胞术进一步证实了，与对照组LoxP相比，PKO小鼠中CD11b + / F4 / 80 + 双阳的巨噬细胞增多（图7D和7E），CD11c + CD11b +F4 / 80 +三阳的M1型巨噬细胞增多（图7D和7F），CD206+ CD11b + F4 / 80 +三阳的M2型巨噬细胞减少（图7D和7G），脂肪组织M1/M2的比例更高（图7D和7H）。以上结果表明，POMC神经元特异性SIRT6敲除导致脂肪组织炎症水平增加。
结论
研究表明，POMC神经元sirt6是调控机体能量稳态的重要调节因子。过表达Sirt6可显著改善了HFD诱导的小鼠肥胖，敲除POMC神经元Sirt6可通过影响小鼠能量摄入的增多和能量消耗的减少促进了小鼠体重的增加。机制研究表明，POMC神经元Sirt6的缺失导致了瘦素信号转导异常。这些结果进一步表明，Sirt6是维持机体能量稳态的重要调节因子。