综述 | 隆德大学：胰岛细胞中的MicroRNA网络：正常功能和2型糖尿病
编译：小北，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：MicroRNA Networks in Pancreatic Islet Cells: Normal Function and Type 2 Diabetes
译名：胰岛细胞中的MicroRNA网络：正常功能和2型糖尿病
期刊：Diabetes
IF：：7.199
发表时间：2020年5月
作者： Lena Eliasson
单位： 隆德大学
DOI：10.2337/dbi19-0016
背景介绍
目前有2654个成熟的microRNAs存在于人类基因组中。成熟的miRNAs是一组小的非编码RNAs，参与对细胞命运特异性和细胞功能调整所必需的转录后基因调节。因此扰乱miRNA的表达通常与人类疾病的发展相关，这也包括T2D及其并发症。
经典的miRNAs可能编码单个基因（单顺反子）、基因簇（多顺反子）或者在一个宿主基因的内含子区域并且由RNA聚合酶II改编形成初级miRNAs（图1）。经含Drosha和DGCR8的微加工复合体将初级的miRNAs分成发夹结构的miRNAs前体。一旦经Exportin 5转运至胞浆中，RNase III Dicer产生双链的miRNAs传递至AGO，这将一条链形成成熟的miRNA。AGO与成熟的miRNA形成了RISC复合体。通常miRNA的2-7个核苷酸位置被认为是种子区域，能够与靶向mRNA的3’端UTR区域配对。通过mRNA裂解、翻译抑制或者mRNA降解抑制转录后翻译。尽管miRNA结合的区域大多在3’端UTR，近期的研究利用基于CLIP的技术发现miRNA同样在蛋白编码的序列（CDSs）区域结合，打开了miRNA调节新的可能。
MiRNAs与靶向mRNA配对对miRNAs发挥功能非常重要。由于短的种子区域，一个miRNA有数以百计的不同靶基因。另一方面一个靶基因也能被多个miRNAs影响。尽管miRNAs在种系中高度保守，它们的靶基因是变化的。因此讨论miRNA集簇与miRNA家族的概念是非常重要的。一个miRNA集簇被认为是一组从同一基因集簇转录的miRNAs，属于同一家族的miRNAs具有相同的种子序列并且具有相同的靶基因，但是不一定在基因组同一定位转录。以胰腺胰岛素中的miRNA为例发现miR-200家族（1号染色体上的miR-200a、miR-200β、miR-429以及12号染色体上的miR-141）富集。基于种子序列和RNA折叠能量的最低值一些计算机靶向预测的工具已经可行。但是全基因组miRNA靶向研究仍然存在的挑战是尽量减少假阳性预测。
胰岛在我们的存活中非常重要，它调控者血液中葡萄糖的内稳态。胰腺胰岛中的细胞主要是分泌胰岛素的β细胞和分泌胰高血糖素的α细胞。糖尿病发病机理的原因是在高糖状态下胰岛素的分泌和低糖状态下血糖素的分泌之间的平衡被破坏。胰腺中β细胞在糖尿病发展中备受质疑，但是近期的研究发现经典的T2D是在靶组织中升高的胰岛素耐受和受损的β细胞补偿机制联合导致的。这一结论再次被证实，研究者将一个包含新被诊断糖尿病患者的Swedish队列重新分类。一个重大发现是病人被划分为五个不同的亚群，包括非自体免疫的糖尿病和80%表现先胰岛素分泌能力降低。这也再次支撑了结论，受损的β细胞不仅对疾病的进程发挥作用对于T2D的驱动也非常重要。
对胰岛富集miR-375研究的发表已有15年。目前对miR-375的认知确定miR-375在胰岛β细胞中具有多样的功能，包括发育、增殖、分泌等。此外其他的miRNA同样在胰岛β细胞中发挥重要作用。人类T2D捐赠者和糖尿病动物模型的胰岛中发现miRNA差异表达并不意外。MiRNAs的水平受代谢底物的调节，在糖尿病前期血液中葡萄糖和脂肪酸的浓度是升高的。此外，miRNAs作为一个变阻器能够调节靶基因的表达在一个合适的水平。因此，miRNAs对于β细胞补偿提高的需求以分泌更多的胰岛素是理想的。的确，一些差异表达的胰岛内miRNAs具有此功能。此外在糖尿病之前或者发展过程中其他miRNAs的表达变化是基因或者miRNA表达调节缺陷造成的，这将导致β细胞不能分泌足够的胰岛素。在展望中研究者首先聚焦于现阶段miRNAs如何参与调节胰岛素分泌和T2D的发展中。随后研究者尝试总结了胰岛miRNA研究的挑战和机遇。
结果
miRNAs在胰岛β细胞中的重要性
miRNAs在胰岛β细胞的发育和功能的重要性是通过研究β细胞特异的Dicer1小鼠实现的。一些不同的β细胞特异的Dicer1小鼠模型已经构建，并且提供了不同的线索表明miRNA是如何在β细胞中协调作用（表1）。在早期阶段Dicer1敲除能够降低大量的β细胞，但是在成年期敲除将导致功能缺失。当Dicer1在Ins1的启动子区缺失时将导致小鼠严重的糖尿病。MiRNAs在确定细胞命运中的作用在β细胞中是一个明显的例证。MiRNAs能够抑制被禁止基因的表达，利用他莫昔芬诱导的Dicer1在Pdx1启动子区域缺失。综上，这些研究都说明了miRNA在发育、细胞命运、增殖以及维持胰岛素的产生和分泌等多个过程中的重要作用。
缺失或者敲低β细胞中Dicer1整个miRNA敲除清楚的说明了β细胞生物学中的多个信号通路受miRNAs影响。然而为了进一步获得β细胞中特异miRNA的功能信息，研究的重点放在了单个miRNAs或者miRNA家族及其靶基因。在胰岛中最丰富的miR-375是第一个被检测的miRNA。过表达miR-375将导致细胞外排降低并且降低胰岛素的分泌。后期敲除miR-375将导致β细胞的数量降低。然而在过表达的小鼠模型中没有明显的表型。细胞系和原代啮齿动物细胞中miR-375的调节提示其在增殖、胰岛素生物合成、离子通道活性以及细胞外排中发挥重要作用。同样，在人类胰岛细胞中通过加入miR-375能够恢复β细胞的表型。正如之前的假说miRNAs调谐发挥功能，miR-375作为一个典型的miRNA能够在细胞中表达合适的水平，过高或者过低都会损害细胞的功能。
另一个在胰岛中丰富的miRNAs是miR-29家族(miR-29a/b/c)的成员，这些miRNAs由两组不同的miRNA集簇转录并且包含相同的种子序列，但是表现出差异调节，因此表现出不同的功能。MiR-29家族成员在β细胞中具有多样的功能，下调后能够提高Mct1的表达，并且通过靶向Onecut2和Stx1提高细胞外排，通过靶向Mcl-1 mRNA促进凋亡。
MiR-7和miR-200家族是胰岛素中丰富的miRNAs。MiR-7在种系中高度保守并且来源于三个不同的前体。在小鼠β细胞特异的过表达miR-7a通过靶向参与囊泡融合和SNARE活性的基因降低胰岛素的分泌，例如Snca、Cspa、Cplx1。MiR-200家族包含五个成员，在小鼠β细胞中特异的敲除miR-200a/miR-200b/miR-429或者miR-200c/miR-141发现这些miRNAs能够调节β细胞的存活。miR-200过表达将引起凋亡和T2D的发育，反之亦然，miR-200敲除能够保护β细胞免受凋亡并且使T2D好转。
刺激-分泌阐释了葡萄糖摄入通过增加代谢、电活动、细胞内Ca2+浓度以及细胞外排等导致胰岛素分泌增加，在β细胞功能中发挥重要作用。以前的研究强调了miRNAs在胰岛素分泌的不同亚过程中的重要性。另一篇综述中也强调了miRNA参与β细胞的存活和发育。总而言之，研究中心对单个miRNAs和特异miRNAs家族如何影响β细胞内特异基因的表达以及如何影响胰岛素分泌。接下来研究者探究了miRNAs复合体如何影响β细胞的功能，并且研究了哪些miRNAs能够影响单个或者多个生物学信号通路。
健康和糖尿病群体胰岛细胞中的miRNAs
鲜有报道研究健康群体和糖尿病群体胰岛中miRNA整体的差异表达。Kameswaran等人在3 ND和4 T2D的胰岛中进行了小RNAs的高通量测序以及qPCR，确定了16个miRNAs的表达在T2D胰岛中是下调的，这一变化受表观遗传调控。大多数的miRNAs在β细胞中的表达水平高于α细胞。利用AGO2免疫共沉淀进行靶基因确定发现靶基因参与细胞存活信号通路。在另一项研究中利用global Taqman miRNA arrays，Locke等人发现在人类T2D胰岛中miR-187的表达升高，同时利用qPCR实验进行了检测。Kameswaran发现 MiRNA是上调的，并且有趣的是miR-187的表达与胰岛素分泌负相关，在小鼠中过表达miR-187发现胰岛素的分泌降低。由于研究中人类胰岛的匮乏，关于T2D胰岛中miRNA差异表达的有效信息是从啮齿动物模型中获取的。赵等人比较了糖尿病耐受（B6）和糖尿病易患者(BTBR)胰岛中miRNA的表达发现不仅miR-375高表达，miR-127、miR-153以及miR-200家族在胰岛中也高表达。在人类组中中miR-375和miR-127同样在胰岛中的富集要高于肝脏和肌肉组织。从B6和BTBR小鼠中获取的数据也提示miR-184在胰岛中的表达受肥胖增加而抑制，然而miR-132/miR-212、miR-133a、miR-185、miR-152、miR-126-5p、miR-34a/b的表达升高。在人类T2D捐赠者的胰岛中发现miR-184的表达随后降低，这也提示miR-184是疾病发展过程中β细胞补偿机制的一部分。
在小鼠中，T2D模型GK小鼠的胰岛中整体miRNA表达分析发现在GK胰岛中主要的miRNAs表达升高，并且确定前10个表达升高的miRNA是miR-132/212、miR-142-3p/5p、miR-130a、miR-124、miR-335、miR-376a、miR-433以及miR-409-3p。尽管这些miRNAs主要影响参与转运和分泌过程的基因，一些潜在的基因同样出现在生物网络矩阵中（图2）。的确，关于GK中上调的miRNAs及其靶基因的机制研究发现miR-335靶向Snap25、Stxbp1、Syt11调节细胞外排的基因，而且miR-130a/miR130b/miR-152调节Pdha 1、Gck参与能量代谢。
图2 依据GK胰岛中上调的miRNA预测的mRNA靶基因及其GO富集分析
一些研究探究了T2D中特异miRNAs的差异表达，从不同糖尿病动物模型中追踪了整个的表达图谱。MiR-184是人类T2D胰岛中下调的miRNAs之一，啮齿动物模型中miR-184表达降低对Ago2、miR-375的表达具有影响，这将提高β细胞的增殖，提高胰岛素的分泌。因此miR-184是参与糖尿病发挥发展中β细胞补偿机制的典型miRNA。重要的是，补偿机制中的miRNAs主要影响了β细胞的增殖和凋亡。一些补偿机制中的miRNAs首次在怀孕期间β细胞量增多中被发现，例如miR-338。Jacovetti等人发现miR-338在怀孕期间表达降低。此外抑制miR-338能够促进β细胞的增殖，保护细胞免受凋亡。最终研究者发现miR-338在高脂饮食和ob/ob小鼠中降低，明显的说明了在糖尿病发展过程中扮演补偿的角色。有趣的是DLK1在怀孕期间是上调的。编码DLK1的基因区域能够编码许多miRNAs，这一区域在T2D胰岛中是高度甲基化的。在这一区域中表达的miRNAs在T2D胰岛中是下调的。利用小鼠胰岛bTC6细胞进行试验，该区域DNA甲基化转移酶被活化后甲基化的程度增加、miRNA的表达降低、并且细胞因子诱导的β细胞死亡的敏感性增加。总之DLK1-MEG3区域和miRNAs 能够促进β细胞扩大、保护β细胞在糖尿病发展之前死亡。参与这组补偿机制的有miR-375、miR-132/miR-212。与此同时，在糖尿病中其他差异表达的miRNAs导致β细胞功能异常，包括miR-130a/b、miR-152、miR-7、miR-204、miR-200c。
近期本领域的研究都聚焦于确定胰岛细胞特异的或者富集的功能miRNA并且进一步在胰岛素分泌的细胞系或者原代单个β细胞中进行验证。很少有研究聚焦于细胞特异的miRNAs，有两项研究利用分离人类α和β细胞仅检测出少量细胞特异的miRNAs。最近的研究在高脂膳食喂养的肥胖性高血糖小鼠中绘制了α和β细胞中miRNA表达图谱，以低脂喂养的小鼠作对照发现miR-132在α细胞中高度差异表达。尽管在T2D中胰高血糖素分泌受损，仍然具有从α细胞到β细胞转化的潜能，说明miRNA在细胞生物学中非常重要。在本领域研究面临的一个困难是缺乏令人满意的细胞系模型。
MiRNA研究未来的挑战和机遇
依据现有对miRNAs的认知发现，在T2D中miR-375、miR-200家族、miR-127在胰岛富集；miR-7、miR-184、miR-187、miR-132/212、miR-130a/b、miR-152中差异表达。现在对胰岛miRNAs的认知较少并且此部分miRNA的研究面临巨大的挑战和机遇。例如，现在的发现大多数miRNA及其靶基因是广泛表达的胰岛细胞miRNAs，同时无论是低表达还是适度表达的miRNAs在糖尿病患者中也是受到破坏的。然而，探究低表达miRNAs的个体效应有望生成效应小的边缘表型。为了绕过这部分，组合的方法来控制多个差异表达的miRNA水平是理解胰岛细胞病理生理过程中低表达/适度表达的miRNAs的关键。最终，miRNAs具有极大的可能用于临床应用，作为生物标记物。但是仍然面临一些挑战。下面研究者列举了胰岛miRNA研究的四个热门（图1）：miRNA的转录调节、miRNA家族和多变靶基因的不守恒、miRNA-mRNA相互作用网络的复杂性、miRNAs作为糖尿病治疗的工具。
图1 胰岛miRNA研究面临的机遇和挑战
一些胰岛的研究发现不同环境的刺激能够调节miRNA的表达例如糖、脂肪和生长因子通过胰岛特异的转录因子。一些基因内的miRNAs能够与宿主编码的基因协同作用。然而大多数的miRNA特异的转录因子独立调控。当前，一些胰岛中参与miRNA转录调节的信号通路已经做了分析。研究者发现miR-132/miR-212集簇的转录调节依赖于cAMP的存在，是一个PKA依赖的过程，参与调控CRTC1、CREB和CAMTA1等转录调节因子。对于其他miRNAs，例如miR-204的表达是通过葡萄糖介导的TXNIP调节表达升高，而miR-184通过血糖调节的AMPK活性的改变而降低。此外，NeuroD1能够与Pdx1协同作用调节miR-375的表达。理解miRNAs的转录调节机制为深入探究其在糖尿病发展中的作用是非常重要的。
另一方面是miRNA的表达是如何通过表观学和其他非编码RNAs的变化进行调控的。研究者发现在T2D中一些miRNA基因在DLK1-MEG3集簇中高度甲基化的，这一结果提示miRNA的表达受表观遗传学调控。此外不同性别间不同程度的DNA甲基化与miR-660和miR-532的差异表达相关。其他类型的非编码RNAs也能调节miRNA的表达。有证据表明长链非编码RNA H19能够抑制let-7，并且环状RNAs ciRS7和circHIPK3能够分离miR-7。转录后调控网络也将是未来的一个挑战，同时也将是更高理解胰岛细胞复合体调节作用的机会。然而生物过程的综合准确理解只能通过传统的分子生物工具进行仔细验证。
miRNA家族和多变靶基因的不守恒
miRNA家族如同基因组内的元件，在进化过程中经过很长的时间出现。显著的是，将它们的调节作用纯化分离会发现miRNAs的一些新功能。报道称在不同的基因组中miRNAs缺失时频繁的。MiRNA的进化的异质性导致了许多miRNA家族的种系特异性。的确，与人类或者小鼠已经确定的基因组相比，有超过600个成熟的miRNAs仅在人类基因组中有发现。以miR-941为例，其在多能干细胞中是高表达的并且参与脑的发育和功能。在鼠的糖尿病模型中描述人类特异的miRNAs非守恒的调节功能是一个挑战，这就像在胰岛中研究灵长类特异性的lncRNAs遇到的困难是一样的。另一个挑战来自于miRNA-靶基因相互作用，多样靶基因是由于在不同器官中相同基因靶向的3’UTR差异造成的。尽管大多数哺乳动物中mRNAs是保守的miRNA的靶向，在人类基因组中有50%的预测miRNA的靶向在其他有机体中并不是保守的。在一项大规模研究中确定了许多miRNAs的非经典的和非保守的位点，包括let-7c、miR-103、miR-106b、miR-141、miR-15a、miR-16、miR-17-5p、miR-192、miR-20、miR-200a、miR-215。在人类和鸡原代软骨细胞中利用控制miR-140的表达水平进行mRNA表达谱分析发现miR-140的许多非保守的靶基因。甚至在最接近的物种如老鼠中，在β细胞中富集的miR-375能够差异调节电压门控钠通道，导致该通道稳态失活的变化。
miRNA-mRNA相互作用网络的复杂性
数学与生物学结合的发展使完全分离细胞网络中的复合体有许多可能。MiRNAs在生物学系统中扮演变阻器的角色，使其完好进入计算机模型中更高的理解其扮演的角色。单个miRNA具有许多不同的靶基因，单个mRNA也可能由多样的miRNAs靶向，这就说明在miRNA和mRNA之间存在一个复杂的调节网络。重要的是miRNAs能够靶向调控相同生物学信号通路的多个基因。研究者收集了GK小鼠的胰岛中10个上调的miRNAs的靶基因进行信号通路分析，GO分析发现基因在“转运和分泌相关基因”这一信号通路中富集（图2）。同时也发现了其他富集的生物学过程，每一个信号通路都具有各自独特的miRNA-mRNA相互作用网络。MiRNA介导的胰岛素分泌的复杂性开始出现。
未来对于这些网络的研究可以综合基因和表观遗传因子。这是一个包含许多共调控过程的挑战，但是利用新的生物信息学的方法使解决这一问题具有极大的可能。但这必须考虑输入数据的质量，例如miRNA的种子序列很短，这就使得许多假阳性的靶基因升高，这也强调了为什么靶基因的生物学验证是准确的网络模型所必需的。
miRNAs作为糖尿病治疗的工具
基于miRNAs能够通过多个细胞信号通路影响胰岛素分泌，使它们具有成为良好治疗靶向的前景。当前一些参与者在临床试验的1期和2期。例如基于LNA的药物能够抑制miR-92，在伤口愈合方面具有潜能。为了治疗T2D，一些动物模型中的研究策略可能转化向人类。在这些研究中已经利用化学修饰解剖等不同的方法沉默miRNAs。带有修饰骨干的LNA分子在血液中更加的稳定，将有益于未来的研究。然而，像任何药物发展的策略一样。治疗的一个巨大挑战是这些RNA的组织特异性传递。在本研究中研究者全身注射激动剂antagomir-132发现胰岛素中miR-132水平降低以及小鼠随后的血糖改善。尽管本领域“概念证明”具有前景工作，基于RNA的药物特异性传入相关的细胞/组织是必需的。利用miRNAs作为药物靶向的另一机制是利用miRNA调节的碱基配对机制，对特异基因的突变体设计引物。利用基于RNA的miRNA抑制剂仍然有许多挑战。当前特异性和脱靶效应的复杂性、抑制剂的敏感性、先天性免疫反应以及确切组织/细胞的传递对于antagomirs在应用之前的发展是需要的。然而利用miRNA抑制剂的概念对于糖尿病及相关并发症的个性化诊断和治疗提供了新的方法。
结论
研究者通过本次研究有望重新回顾胰岛素中miRNAs的研究，以及利用miRNA antagomirs治疗T2D的可能性。研究者说明了胰岛中miRNA研究的挑战和机遇。从胰岛中第一个miRNA的发现15年来已经挖掘了巨大的数据。我们共期待一个繁荣的miRNA研究时期，推进个性化药物治疗时代的到来。
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