综述 | 英国爱丁堡大学医学院皇后医学研究所Neil CHenderson等：使用单细胞转录组学揭示纤维化
编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
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纤维化主要病理特征是细胞外基质过度积聚，器官组织内纤维结缔组织增多，实质细胞减少，持续进展可导致器官结构破坏和功能减退，乃至衰竭，严重威胁人类健康和生命。尽管目前已经很大程度上理解了调节该过程的细胞和分子机制，但可用于纤维化治疗的选择仍然非常有限。但由于单细胞组学技术的迅速发展，这一问题将得到解决。例如单细胞RNA测序（ScRNA-seq）可以通过一个超高的分辨率来监测单个病原细胞群变化（图1），通过ScRNA-seq分析鉴定新型细胞类型和状态不仅极大地增进了人们对疾病潜在机制的理解，而且还加速了对一些新的、高度相关的潜在治疗靶标进行精确鉴定。在这篇综述中，作者将就单细胞转录组学如何推动我们对纤维化疾病的发病机理认识上进行讨论
论文ID
原名：Unravelling fibrosis using single-cell transcriptomics
译名：使用单细胞转录组学揭示纤维化
期刊：Current Opinion in Pharmacology
IF：5.203（2区）
发表时间：2019.10.25
通讯作者：Neil CHenderson
通讯作者单位：英国爱丁堡大学医学院皇后医学研究所
DOI号：10.1016/j.coph.2019.09.004
综述内容
1 肺
肺纤维化的发生和发展是由多个细胞谱系之间复杂的相互作用驱动的。由于巨噬细胞代表着多样化且可塑性的群体，并在调节包括器官纤维化在内的众多病理过程中的发挥重要性，因此，ScRNA-seq特别适合在肺纤维化背景下进一步研究这种细胞作用。Chakarov人进行了一项非常有趣的研究并证实ScRNA-seq在巨噬细胞异质性研究中的重要价值，他们在健康小鼠肺中监测间质巨噬细胞（IM），发现了Lyve1loMHCIIhi和Lyve1hiMHCIIlo IM两个不同的种群，它们具有不同的转录谱。遗传命运映射模型将这些IM群体鉴定为两个独立的单核细胞衍生细胞谱系，它们位于肺中不同的解剖位点，并具有不同的功能。有趣的是，IM中的这种二分法是相对保守的，包括在小鼠心脏，脂肪和真皮中以及人肺在内的组织。Lyve1hiMHCIIlo IM的选择性切除加重了肺纤维化，从而突出了其在肺损伤中的关键作用，所以将这些细胞鉴定为潜在的抗纤维化靶标。类似地，Aran等人在肺纤维化的鼠模型中使用ScRNA-seq，鉴定了原纤维形成的过渡性巨噬细胞群体，其位于单核细胞衍生的巨噬细胞和普通肺泡巨噬细胞之间。在患有特发性肺纤维化的患者的样品中，该过渡群体表达基因的直向同源基因明显上调。此外，这些促纤维化的过渡性巨噬细胞也被证明可以通过分泌PDGF-AA来调节成纤维细胞生物学，从而可能为深入了解目前批准用于治疗肺纤维化的少数药物之一尼达尼布(Nintedanib)的作用机制。
在肺纤维化过程中，间充质细胞负责细胞外基质的产生，最终导致结构畸变和肺功能下降。ScRNA-seq已被用于表征健康小鼠和纤维化小鼠肺中的肺间质细胞异质性。结合转基因报告基因系，这导致健康肺间充质的空间和转录图的生成，揭示了包括负责肺泡生长和再生的间质肺泡龛细胞（MANC）和负责损伤愈合期间形成瘢痕组织的成肌纤维祖细胞（AMP）两种不同的种群。通过比较博来霉素诱导的纤维化小鼠肺中间充质细胞的研究发现了广泛的细胞异质性，发现结论略有不同。可能原因是由于肺损伤时间细胞分离技术和所用分析方法的差异所致。Xie等人提供了健康和纤维化肺病中间充质细胞异质性的计算分析，确定了纤维化小鼠肺中的七个不同的间充质细胞群，包括损伤特异性PDGFRβhi群；相反，Peyser等人认为活化的成纤维细胞与对照细胞是相似的而不是唯一的。有趣的是，两项研究都对使用Acta2作为标志物来定义疾病相关的成纤维细胞产生了怀疑。
此外，ScRNA-seq还在人肺中进行了广泛研究。Reyfman等人提供了人类肺纤维化的首个单细胞图谱，分析了来自八位病因不同的肺纤维化患者和八份未受伤的供体肺样本中的70000多个细胞。为了表征人纤维化肺中上皮异质性的变化，Xu等人在三个对照组和六个特发性肺间质纤维化（IPF）患者样品上进行了ScRNA-seq检测，发现了肺上皮细胞发生显著变化。
图1 使用单细胞转录组学方法解析细胞状态、亚群、分化动力学和细胞间相互作用
2 肝
迄今为止，肝脏中的ScRNA-seq主要集中在表征肝脏动态平衡过程中的细胞景观。在健康、稳定的肝脏中绘制这些参考图谱是一个重要的平台用于研究肝脏疾病发病机理。Halpern等人使用ScRNA-seq和空间定位的地标基因来注释小鼠肝小叶上不同肝细胞亚群的分区，将其分为门周围和中心周围区域，研究发现中间小叶可能具有特定的功能。进一步研究中利用干细胞的空间信息与配对细胞测序结合使用，表征肝脏中的内皮细胞分区。肝脏中的许多病理状况都显示区域性及空间异质性，但是区域性在疾病发生和发展中的作用仍然是未知的。在未来几年中，ScRNA-seq可能会开始阐明细胞分区在肝病中的作用。
尽管我们对使用啮齿动物模型积累的肝纤维发生机理的理解有了迅速的进步，但仍缺乏对潜在的治疗靶点和有效的治疗方法的认识，因此有必要了解人类肝脏在健康和疾病中的细胞状况。迄今为止，已有两项关于人肝的全面的ScRNA-seq研究。MacParland等通过对5个健康人类肝脏中获得的8000多个实质细胞和非实质细胞进行转录组测序，鉴定了包含20个来自主要肝细胞谱系的离散细胞亚群。其中人类肝脏中巨噬细胞的异质性的分析，确定了2个不同的种群-早期招募的促炎性巨噬细胞和常驻的Kupffer细胞。McParland等强调指出，由于肝细胞特别容易发生酶解，组织制备方法很重要。在第二项人类肝脏ScRNA-seq研究中，Aizarani等人使用了Diffusion pseudo-time (DPT)对人类肝脏的肝细胞和内皮细胞的功能进行分类。有趣的是，对小鼠和人类数据的比较发现基因表达的进化保守性有限，再次突出了小鼠与人类生物学之间的重要差异。
在肝纤维化的ScRNA-seq研究集中于肝星状细胞（HSC）/成肌纤维细胞和免疫细胞。目前，HSC被认为是肝纤维化过程中成纤维细胞的主要来源，与病因学无关，但是必须注意的是这些数据均来自小鼠肝纤维化模型，而非人类研究。在啮齿动物肝纤维化模型中的ScRNA-seq研究表明，成纤维细胞在肝纤维化肝脏中是异质性种群。虽然可以通过通用激活S100a6以及纤维胶原蛋白的上调来识别激活的成纤维细胞，但某些趋化因子的表达仅限于特定的亚群。高脂、高糖、高胆固醇的“西方饮食”-喂养的小鼠肝脏和骨髓中髓样细胞亚群的特征揭示了其在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）进展过程中对特定炎症表型的适应性，其特征是在巨噬细胞和树突状细胞亚群中炎症性钙卫蛋白的下调（S100a8/a9），从而影响炎性极化和急性无菌性肝损伤。
3 肾
ScRNA-seq广泛用于研究肾脏在发育、体内稳态、癌症和纤维化中的细胞组成，对其疾病的发病机制研究做出重要的贡献。Park等通过与来自大鼠的大量RNA-seq肾脏数据、来自人类免疫细胞的微阵列数据和转基因小鼠报告基因系相关联，生成了健康小鼠肾脏的单细胞图谱，为18个先前定义的肾脏群体提供分子定义，并提出3种新型细胞类型包括具有与分布管的主细胞（PC）和插层细胞（IC）相似的表达谱的过渡细胞。有趣的是，作者证明了Notch介导的IC向PC的转变可能是小鼠模型和慢性肾脏病患者发生代谢性酸中毒的原因。
纤维化是几乎所有类型的慢性肾脏损伤的最终常见途径，尽管人们公认成肌纤维细胞是肾脏中产生瘢痕的细胞，但其起源仍是一个有争议的问题。使用共生模型，Kramann等人证明只有一小部分的成肌纤维细胞来自循环细胞。该群体（PDGFRβ+ CD45+）和常驻成肌纤维细胞（PDGFRβ+ CD45-）的ScRNA-seq表征证实了这是两个不同的细胞群。虽然常驻的成肌纤维细胞群体与基质产生密切相关，但循环产生的成纤维细胞具有与免疫反应机制相关的单核细胞样表型。
尽管在利用ScRNA-seq理解疾病发病机理方面已取得了巨大进展，但在使用该技术时仍需要考虑许多因素，包括由于细胞脆性和/或在组织解离过程中难以释放而导致的某些细胞类型的代表性不足，由于延长的解离过程导致的细胞应激假象，以及冷冻的组织无法生成高质量的全细胞ScRNA-seq数据。单核测序（SnRNA-seq）是一种新兴的方法，可以帮助解决这些问题。通过对每个细胞核里的基因表达信息分析，可以用于分析生物库冷冻组织。小鼠肾脏SnRNA-seq与标准ScRNA-seq比较发现SnRNA-seq方法可减少对压力相关基因的检测，而且细胞类型增加，包括肾小囊脏层细胞，内皮细胞和闰细胞。此外，纤维化肾脏的SnRNA-seq发现了新的和罕见的细胞类群，提高了分辨率。在未来几年中SnRNA-seq的使用可能会增加，并进一步扩大了我们对纤维化疾病潜在机制的理解。
结论
单细胞转录组学的快速发展领域已经在组织纤维化的背景下带来了重要的新发现。此外，诸如单细胞表观基因组学，单细胞蛋白质组学和空间转录组学等发展中的技术将使研究界能够以更高的分辨率进一步定义调节纤维化的细胞和分子机制。这些前沿方法将增加我们对纤维化在各种形式的组织纤维化中如何运作的理解，并如何产生合理且可能具有药物作用的治疗靶点，以治疗纤维化患者。
评论
纤维化是细胞外基质的过度积累，是全球医疗保健的主要负担。尽管我们对调节纤维化的机制研究有了重大进展，但是纤维化患者的治疗仍然困难。然而，单细胞转录组学技术的快速发展，使得能够在纤维化的情况下以前所未有的分辨率分析病原单细胞群体。本篇综述总结了单细胞转录组学如何推动对纤维化疾病发病机制的了解，以及这些前沿方法如何精确鉴定各种纤维化疾病的治疗靶点。
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