鸭坦布苏病毒多克隆抗体及其制备方法

专利名称：鸭坦布苏病毒多克隆抗体及其制备方法 技术领域： 本发明属于家禽基因工程技术领域，具体涉及鸭坦布苏病毒多克隆抗体及其制备方法。 背景技术： 2010年4月以来，我国主要蛋鸭养殖区福建、山东、浙江、上海、江苏等地陆续暴发一种以蛋鸭、种鸭产蛋骤然大幅下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为主要病变特征的急性传染病，造成约1. 2亿只蛋鸭和1500万只肉鸭发病，经济损失达数十亿元。随着病原学研究的深入，该病被确诊是由一种新型黄病毒鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)引起的。鉴于当前如此严峻的形势，建立鸭坦布苏病毒抗体对该病的主动免疫保护 和流行病学调查具有极其重要的意义。研究发现，鸭坦布苏病毒编码结构蛋白(C、PrM和E)和非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5)。其中，E蛋白在病毒受体结合、侵入和融合方面起到了关键的作用，是病毒的主要结构蛋白，具有较好的免疫原性，是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原，也成为了宿主抗感染免疫的重要保护性抗原。因此，筛选新的E蛋白等位基因进行疫苗研发无疑具有重要的现实意义和市场开发价值。  发明内容 本发明的目的是提供一种鸭坦布苏病毒多克隆抗体及其制备方法，即以新的鸭坦布苏病毒E蛋白基因作为免疫原产生的多克隆血清抗体，保护动物免受鸭坦布苏病毒的感染。本发明多克隆抗体，是以氨基酸序列为SEQ ID NO 1的鸭坦布苏病毒E蛋白为免疫原制备的。上述的多克隆抗体的制备方法，包括如下的步骤I)取鸭坦布苏病毒E蛋白添加到弗氏完全佐剂中至浓度为lmg/ mL,混均后制成乳剂来免疫新西兰大耳白兔；2)在第一次免疫后，每隔一周加强免疫一次，其中第二、三次免疫在乳剂中添加弗氏不完全佐剂，第四次注射抗原溶液；3)自第一次免疫后的第五周起取血，室温下待血清完全分离，离心后的血清经过纯化后获得为本发明制备的鸭坦布苏病毒多克隆抗体。本发明制备的多克隆抗体用于预防鸭坦布苏病毒病。本发明以纯化的鸭坦布苏病毒的重组E蛋白作为抗原注射新西兰大耳白兔获得多克隆血清，具有较好的免疫保护效果。将5日龄和35日龄的DTMUV阴性麻鸭注射多克隆血清后，对黄病毒的攻毒保护率分别达到100%和90%。用对开发敏感性高、特异性强的鸭坦布苏病毒保护性抗体血清提供实验基础和较大的市场价值。 具体实施例方式下面结合具体实施方式 来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护范围内。一、鸭坦布苏病毒E基因的扩增将临床分离疑似DTMUV的病料处理后接种SPF鸡胚盲传三代后，PCR扩增鸭坦布苏病毒E基因全长，引物序列如下E-F: 5， AGAATTCATGTTCAGCTGTCTGGGGA， 3 (EcoR I)E-R: 5’ ACTCGAGTTAATTGACATTTACTGCCAGG ’3 (Xho I) 按以下参数在PCR仪上进行反应98 °C预变性30 S，然后以98 V 10 S、55 V15 s、72 °C I min进行25个循环。扩增产物进行测序后将E蛋白基因序列(SEQ ID NO :2)在NCBI上Blast比对，同源性最高为97%，表明扩增的样品为新的病毒株。其翻译的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。同时，对同一 DTMUV的病料感染的不同SPF鸡胚，按照上述记载的条件进行扩增，扩增出的基因测序结果都一致，证明没有在扩增过程中产生碱基的错误。将E蛋白基因的核苷酸(SEQ ID NO :2)5'端和3'端分别加上EcoR I和Xho I酶切位点，送基因公司进行全基因合成 二、基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得1、E基因片段连接到pET_28a(+)载体上并转化DH5a感受态细胞(I)合成的E基因与pET_28a (+)载体质粒分别利用EcoR I和Xho I酶进行双酶切。(2)酶切后目的片段的回收双酶切产物通过1%琼脂糖回收胶。(3)连接反应根据载体片段与插入片段摩尔数比为1: 2 10的原则，设计连接体系，16 °C连接过夜。(4)连接产物转化E. coli DH5a感受态细胞，37 1孵箱培养过夜。(5)阳性转化子的筛选与鉴定阳性克隆的测序由华大基因公司完成，将测序后的序列与标准合成序列进行核酸序列的Blast分析，与改造后的E蛋白基因的核苷酸(SEQ ID NO :2)完全一致。因此，将构建完成质粒命名为pET-28a(+)-E。2. pET-28a(+)_E 质粒转化 E. coli BL21(DE3)感受态细胞(l)pET-28a(+)_E 质粒的提取。(2)pET-28a(+)_E 质粒转化 BL21(DE3)感受态细胞。(3)挑一株阳性克隆命名为BL21-pET-28a(+)_E菌株。三、发酵、纯化与鸭坦布苏病毒E蛋白制备(I) LB培养基作为种子培养基，含5g/L葡萄糖和5g/L MgSO4 7H20的LB培养基作为发酵培养基，补料为葡萄糖400g/L、蛋白胨24g/L、酵母提取物10 g/L, NaCl 5 g/L、MgSO4 7H20 5 g/L。(2)发酵过程挑取鉴定过的工程菌接种于含卡那霉素的浓度为50y g/ml的LB培养基，37°C振荡培养8小时，作为种子液。将种子液按2%接种量接种于发酵罐中，调节好各参数，37°C，200转，溶氧控制在20%以上。发酵4小时后开始流加补料，发酵6小时后加入0. 3mmol/LIPTG进行诱导表达，表达后6小时发酵结束。(3)镍柱纯化、脱盐(4)亲和层析采用镍离子金属螯合层析柱，重组蛋白可以用含300mmol/L咪唑的洗脱液洗下来，纯度达到90%以上(5)脱盐收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐即得重组蛋白液。·四、多克隆血清的制备(I)动物选择新西兰大耳白兔两只。( 2 )接种途径皮下注射。(3)接种部位脊背，左右脚足垫，左右腹股沟。(4)佐剂使用弗氏完全佐剂(CFA)，弗氏不完全佐剂(IFA)为Sigma公司产品。(5)接种策略I)每只大耳白兔抗原免疫用量1.0 mg。取2. 5 mg E蛋白加弗氏完全佐剂2. 5 mL,顺时针方向研磨直至形成“油包水”样乳剂。2)固定大耳白兔，75 %乙醇消毒，分别在脊背，左右脚足垫，左右腹股沟皮下注射乳化液，注射量2 mL/只。3)每隔一周加强免疫一次，其中第二、三次加弗氏不完全佐剂，第四次注射抗原溶液。4)第五周起于兔耳缘静脉取血将新西兰大耳白兔轻轻放入固定架上，二甲苯涂于耳缘静脉的上中部，用刀片倾斜45度在该处切出0. 2-0. 3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，请按患处10-20秒确定血流停止方可结束。将血液在37°C恒温箱中放置30分钟，在4°C放置过夜。用药铲将血凝块从管壁上拔落，将血液转移至塑料离心管中，4°C 10，OOOg离心10分钟，收集上清液即为抗血清。(6)抗体纯化首先是准备BDV磷蛋白(P24) sepharose CL-4B亲和柱。通常准备5mL或IOmLBDV磷蛋白(P24) sepharose CL-4B填料，在真空瓶中等体积的填料和TBS缓冲液混合，搅拌。抽真空约15min以除去填料中的气泡，否则在柱中形成的气泡影响柱子的容量和分离效果。将BDV磷蛋白(P24)s印harose CL-4B填料缓慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度为lmL/min-2mL/min,避免柱干,利用10倍于床体积并经过预冷的TBS缓冲液平衡柱子。其次是制备抗血清，将抗血清放入冰水或4°C冰箱中缓慢解冻以避免蛋白质的聚集，在蛋白质解冻过程中出现的聚集可通过37°C预热而溶解。加入固体叠氮化钠至浓度为0. 05%，4°C15，OOOg离心5min，移出澄清的抗血清再经过过滤器过滤除去多余的脂肪。将抗血清用TBS缓冲液以1:5的比例进行稀释，再用过滤器进行过滤。以0. 5mL/min的速度将抗血清加入柱中，为保证抗血清与填料的结果，需连续上柱2次并保留上样流出液。用TBS缓冲液清洗柱子至A (280nm) < O. 008后加pH 2. 7洗脱缓冲液，以O. 5mL/min的速度洗脱至所有蛋白均流下来。用已经加入IOOuL中和缓冲液调至pH 7. 4以防止抗体的变性。在柱中加入IOmL pHl. 9洗脱缓冲溶液，按上述方法收集洗脱液至A (280nm) < 0.008。利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。若蛋白浓度低于O. 5mg/mL可加入10%的甘油以便保存，将纯化的抗体分装后在2V _8°C保存。(7)用琼脂糖双扩法检测特异性抗体的效价双向免疫扩散结果显示，在抗E蛋白抗血清稀释度为1:32时，出现明显沉淀线，兔抗E蛋白多克隆抗体效价为1:32。结论E蛋白可以使新西兰大耳白兔产生多克隆抗体血清。 (8) Western印迹检测血清特异性选取BL21 (DE3)菌为阴性对照，同时以纯化后的E-His为阳性对照进行SDS-PAGE，电转移至NC膜上，实施例3中制备的兔抗血清以1:5000稀释为一抗，1:5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG为二抗，检测兔抗E-His血清的免疫反应性。结果表明纯化的E-His蛋白可以与兔抗E-His血清能够发生明显的免疫反应，而BL21 (DE3)在相应分子量位置未见反应条带出现，表明具有良好免疫反应性。五·克隆抗体血清的效果检验免疫血清的检验包括无菌检验、安全检验和效力检验。(I)无菌检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验，结果无菌生长，符合规定。(2)安全检验用8日龄的DTMUV阴性麻鸭5只，各皮下注射多克隆血清O. 5mL;用35日龄的DTMUV阴性麻鸭5只，各皮下注射多克隆血清5ml，观察10天，采食、饮水、健康状况与对照组无明显差异，全部健活。(3)效力检验选择攻毒方法进行效力检验用20日龄DTMUV阴性麻鸭20只，10只各颈部皮下注射多克隆血清O. 25mL，另10只不接种作为对照，接种后14日，连同对照鸭10只，每只鸭各肌肉注射一个最小感染剂量鸭坦布苏病毒液O. 5mL,观察10日，注射血清组保护10只，对照组9只发病。六.免疫血清对不同日龄实验动物的保护性检验(I)用5日龄DTMUV阴性麻鸭20只，10只各颈部皮下注射多克隆血清O. 25mL,另10只不接种作为对照，接种后14日，连同对照鸭10只，每只鸭各肌肉注射一个最小感染剂量鸭坦布苏病毒液O. 5mL，观察10日，注射血清组保护10只，对照组10只发病且其中2只死亡。(2)用35日龄DTMUV阴性麻鸭20只，10只各颈部皮下注射多克隆血清O. 25mL,另10只不接种作为对照，接种后14日，连同对照鸭10只，每只鸭各肌肉注射一个最小感染剂量鸭坦布苏病毒液O. 5mL，观察10日，注射血清组保护9只，对照组9只发病。同时，用临床分离疑似DTMUV的病料，即筛选本发明的鸭坦布苏病毒E基因的材料做感染源，结果表明，已有的鸭坦布苏病毒E制备的抗体免疫效果不理想，而本发明制备的多克隆抗体可以高效的进行免疫保护。 序列表 SEQUENCE LISTING <110> W岛康地恩药业股份有限公司 #岛宝依特 物制药 限公司 <120> Wtt布苏病诗多克隆抗体及其制备方法 <160> 2 <170> Patentln version 3,5 <210>I <211>500 <212>PRT <213>DTMUV protein <400>I 权利要求 1.一种鸭坦布苏病毒多克隆抗体，是以氨基酸序列为SEQ ID NO :1的鸭坦布苏病毒E 蛋白为免疫原制备的。 2.权利要求1所述的多克隆抗体的制备方法，包括如下的步骤1)取鸭坦布苏病毒E蛋白添加到弗氏完全佐剂中至浓度为lmg/mL,混均后制成乳剂来免疫新西兰大耳白兔；2)在第一次免疫后，每隔一周加强免疫一次，其中第二、三次免疫在乳剂中添加弗氏不完全佐剂，第四次注射抗原溶液；3)自第一次免疫后的第五周起取血，室温下待血清完全分离，离心后的血清经过纯化后获得为本发明制备的鸭坦布苏病毒多克隆抗体。 3.权利要求1所述的多克隆抗体用于预防鸭坦布苏病毒病。 全文摘要 本发明涉及一种鸭坦布苏病毒E蛋白多克隆血清及应用。本发明以纯化的鸭坦布苏病毒的重组E蛋白作为抗原注射新西兰大耳白兔获得多克隆血清，具有较好的免疫保护效果。将5日龄和35日龄的DTMUV阴性麻鸭注射多克隆血清后，对黄病毒的攻毒保护率分别达到100%和90%。用对开发敏感性高、特异性强的鸭坦布苏病毒保护性抗体血清提供实验基础和较大的市场价值。 文档编号A61P31/14GK102993300SQ201210480669 公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日 发明者魏波, 凌红丽, 徐丽丽 申请人:青岛宝依特生物制药有限公司, 青岛康地恩药业股份有限公司