CRISPR基因调控细胞稳转株构建技术原理

该种细胞株采用的CRISPRa和CRISPRi技术是新兴的两种基因表达调控工具。CRISPRa采用的dCas9-SAM基因激活系统由个三个组分构成，每个组分分别由单独的慢病毒载体提供：gRNA/MS2表达载体，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64辅助载体。表达这三种组分的细胞株中，用户定制的gRNA募集MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64到gRNA靶位点，从而组装出SAM转录激活复合体。SAM复合体一般结合于靶基因上游启动子区域，通过VP64，p65和HSF1激活结构域之间的协同相互作用实现下游靶基因的转录激活。该种细胞株可以用于基因组的大规模筛选，如文库构建过程，也可用于研究单个或一系列基因的表达功能。

CRISPRi采用dCas-KRAB系统，可实现比RNAi更高效的基因沉默效果，但是对比采用CRISPR敲除构建的功能缺失模型，又有不改变靶基因序列的优点。dCas9-KRAB CRISPRi细胞株使用慢病毒转导gRNA表达载体和dCas9-KRAB（或者dCas9-KRAB-MeCP2）表达载体。细胞株表达的dCas9-KRAB转录抑制复合物结合于靶基因上游区域，阻碍RNA pol进行下游转录，可从源头上抑制基因功能性表达。