科研 | Gastroenterology：IBD患者肿瘤坏死因子拮抗剂疗效影响肠道菌群代谢功能
编译：朱雯君，编辑：小菌菌、江舜尧。
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改变粘膜免疫系统和肠道菌群之间的相互作用，有助于炎症性肠病(IBD)的发病机制。目前尚不清楚细胞因子抑制剂，如肿瘤坏死因子拮抗剂(anti-TNF)如何影响肠道菌群。本文通过对IBD患者的2步纵向研究，探讨了抗TNF药物对肠道微生物群落结构和功能的影响。另外，本文将研究结果与治疗结果进行关联，并调查了抗肿瘤坏死因子治疗前后粪便样本的代谢物模式。
论文ID
原名：Metabolic Functionsof Gut Microbes Associate With Efficacy of Tumor Necrosis Factor Antagonists inPatients with Inflammatory Bowel Diseases
译名：肠道微生物的代谢功能与炎症性肠病患者肿瘤坏死因子拮抗剂的疗效有关
期刊：Gastroenterology
IF：19.233
发表时间：2019.7
通讯作者：菲利普·罗森斯蒂尔
作者单位：石勒苏益格-荷尔斯泰因大学附属医院临床分子生物学研究所
实验设计
2 微生物群落建模
结果
1 肠道菌群失调的特点是慢性炎性疾病
我们在基线调查了IBD、健康对照组(HC)和风湿病患者(血清阳性/血清阴性类风湿关节炎或强直性脊柱炎)的微生物群落结构。本发现队列包括29例患者(IBD=12例，风湿病=17例)抗肿瘤坏死因子治疗启动前后的纵向粪便样本和健康组19例单时间点粪便样本(n=19)。所有样本(包括基线和治疗后干预)的16S rRNA基因测序结果确定了388种系统类型。所有统计算法评估α多样性有固有的优点和缺点,我们使用一组α多样性指数包括(i)观察和(ii)估计(Chao I)丰富度,(iii)物种均匀度考虑丰富(非参数Shannon)和(iv)系统距离(谱系多样性分数)。非参数Kruskal-Wallis检验显示，健康对照组与风湿病组或IBD组之间的基准微生物群落均存在显著差异。为审查特定组两两之间的微生物α-多样性基线差异,我们使用Mann-Whitney U测试,这对IBD与HC组显示α多样性指数显著降低，观察(p = 0.024;图1A)和ii)估计(Chao I)丰富度(p = 0.019;NP Shannon多样性指数(p = 0.0001;图1C)和iv)系统发育多样性(p = 0.017;图1D)。与HC相比，风湿病患者的细菌多样性也降低了，但仅NP Shannon多样性指数显著(图1C)。主坐标分析(PcoA)成员——(Jaccard)和基于丰富度的 (Bray-Curtis)β多样性距离矩阵证明前两个坐标能够独立表示健康/疾病样本描述符状态。Jaccard(图1E)距离的PERMANOVA检验显示IBD、风湿病和HC之间的微生物组成明显不同。同样，基于丰盛度(Bray-Curtis)的分析显示，与HC相比，IBD和风湿病患者有显著差异，但在风湿病和IBD社区之间没有显著差异(图1F)。这些观察结果证实之前的发现显示患者的基线肠道微生物群落IBD的特点是物种数量的减少和丰富度和均匀度下降(α多样性)以及改变群落组成和结构(β多样性)。相比之下, 与HC组相比，风湿性疾病患者肠道菌群只显示群落结构的变化(β多样性),表明即使没有明显的肠道炎症时肠道微生物的疾病影响。
2 抗-TNF治疗对微生物多样性的影响在IBD和风湿性疾病反映于β而不是α-多样性水平
为了分析抗-TNF治疗在炎症性肠病(n =12)和风湿性疾病(n = 17) 对肠道菌群独立的影响,我们评估了首次抗-TNF治疗之前和诱导后2,6，30周的α-多样性指标，用HC组的样本为参考点。观察和估计的IBD患者的物种丰富度和系统多样性在治疗干预开始后增加，并在第30周达到与基线相比显著增加。这种转变是针对对照组的，在30周的治疗后，单纯IBD粪便样本与健康对照组之间的差异变得不显著(图2A、2B和2D)。NP Shannon多样性指数没有类似的差异(图2C)。相比之下，风湿病患者的细菌多样性恢复不明显(图2E-H)。有趣的是,我们未能确定基于α多样性的恢复与未恢复患者之间的区别 (图S2),这也可能是由于样本容量有限。我们下一步调查了β-多样性指数来衡量治疗开始之前和之后纵向菌群组成。我们使用Yue和Clayton距离矩阵来评估个体间的差异，该矩阵不仅考虑了成员重叠，而且还考虑了群落间物种的丰度。对基线和治疗期间(2周、6周和30周)样本之间的距离进行两两比较，结果显示抗TNF -治疗的IBD患者个体间差异增加(补充图3A)。这说明抗TNF治疗可增加IBD患者肠道菌群的异质性。与IBD相比，风湿病患者在治疗期间抗TNF治疗与微生物群的总体差异性降低(治疗第30周与治疗前相比)相关。这表明微生物β-多样性的整体收缩,即风湿性疾病患者有相似性的结果。为了了解观察到的变化的方向性，我们比较了治疗干预前和干预期间健康受试者和疾病组(IBD、风湿病)的差异性，观察到抗TNF治疗使两组患者的微生物群落向健康受试者转移。提示抗肿瘤坏死因子治疗对IBD和风湿病的微生物失调均有较好的纠正作用。再次，临床缓解和非缓解之间没有明显的区别。
3 抗肿瘤坏死因子治疗后的个体系统类型改变
我们接下来测定了基线时健康对照组(HC)与抗肿瘤坏死因子治疗的IBD或风湿病患者之间细菌系统类型指示物的显著不同，并询问这些分类群在抗肿瘤坏死因子治疗后是否会改变其丰度(第30周)。在IBD中，我们发现了HC与未治疗IBD患者之间有显著差异的14个指示性系统类型。在抗肿瘤坏死因子处理后，所有14个已识别的系统类型都失去了指示性物种状态，这表明这些系统类型在抗肿瘤坏死因子处理后得到了标准化(图3A)。在IBD中，粪球菌属(指标值:84.37;p = 0.003)和Roseburia inulinivorans（玫瑰蔷薇菌）(指标值79.25;p = 0.031)为基线时的最高指示因子系统类型(基于p值，与HC相比)。与健康受试者相比，这两种指示性系统类型在第0周时的丰度均有所降低，且在治疗过程中丰度均有所增加，导致HC与IBD在第30周时的显著性降低(图3B)。在风湿病患者中，我们确定了5个指标系统类型，它们在基线和HC之间的丰度上存在显著差异，并且在第30周抗TNF治疗后失去了指标状态。5个指标的OTU, Erysipelotrichaceae(指示值,81.33;p = 0.009)、Dorea(指标值68.81;p = 0.042)在第30周显著增加，成为处理后样本的非指标。
图3:抗TNF干预部分恢复IBD的系统型改变。
4 在IBD和风湿病中较少有稳定的生态的相互作用
由于我们的探索性队列中的多样性测量和个体分类鉴定不能预测IBD的治疗结果，我们接下来使用16S rRNA测序数据的硅代谢模型来推断管腔内微生物群和相关粪便代谢物水平的代谢相互作用。我们推测可能影响TNF拮抗剂反应的是代谢功能而非分类成分。为此，我们使用了最近发表的AGORA资源，这是来自773种人类肠道细菌的宏基因组学数据的综合汇编，旨在基于16s rRNA数据预测微生物群落之间的代谢相互作用。我们将两种不同的细菌有机体之间的生态关系分为互利的相互作用、拮抗的相互作用和资源竞争，这取决于个体伙伴从预测的相互作用中获得的利益。共生和拮抗的相互作用可以增加群落的活力，而种间资源竞争会降低群落的稳定性。有趣的是，预测的相互作用频率在患有IBD或风湿病的患者与健康对照组之间没有显著差异。然而，我们发现在IBD中，以及在风湿性疾病中，在治疗开始时，预测的拮抗作用频率显著降低，只是程度较轻并在治疗结束时部分恢复(图4A)。反之，我们观察到在两种炎症性疾病中肠道细菌的种间资源竞争增强，表明微生物群落的稳定性降低。
5 IBD和风湿病患者的代谢性交叉喂养受损，且与抗TNF治疗缺乏临床疗效相关
为了评估抗TNF治疗是否也影响机体间代谢物交换的速率(或通量)(称为代谢性交换)，我们使用代谢网络模型来预测在使用硅微生物群落模型的单个样本中，细菌群落成员之间的代谢物交换(详细信息参见补充材料和方法)。模拟结果显示，与HC相比，无缓解的IBD或风湿病患者的总代谢交换量基线下降，且在抗TNF治疗30周后仍低于HC水平(图4B)。这与获得临床缓解的患者形成对比，这些患者与HC患者相比，没有显示预期的代谢交换减少(图4B)。这些数据指出不同的微生物代谢特征可能影响治疗效果，有助于临床治疗。综上所述，胃肠道细菌代谢的硅胶模型显示IBD和风湿病肠道菌群的生态系统功能受到严重破坏，抗TNF治疗后部分恢复。抗TNF治疗可恢复IBD中紊乱的肠道微生物群落代谢。
6 抗肿瘤坏死因子治疗可恢复IBD中紊乱的肠道微生物群落代谢
我们接下来的目的是通过第二个独立的IBD纵向队列验证我们的中心假设，即代谢交叉喂养受损与IBD抗tnf治疗的临床结果相关(见补充表7)。在此背景下，我们还旨在研究这些潜在的影响是单独抗肿瘤坏死因子治疗所致，还是反映了生物制剂治疗成功缓解的普遍效应。我们共招募了23名患者(CD=10, UC=13)(队列2)，他们首次接受了抗TNF (英夫利昔单抗;IFX)或抗-α4β7整合素(vedolizumab)抗体治疗，并且收集了在基准状态时和治疗后星期2, 6， 14周的粪便样本 (补充表3)。为了排除先天差异的饮食摄入量可能会影响微生物群落结构,我们评估了一组患者的饮食摄入量(n=7例，抗肿瘤坏死因子治疗;使用经过验证的波茨坦饮食问卷(Potsdam Dietary questionin)，无法观察到缓解或不缓解患者在碳水化合物、纤维、蛋白质或脂肪摄入量方面的显著差异。然而，需要进行全面的评估，以充分了解饮食摄入对预测的肠道微生物群代谢特性的影响。我们进行了抗-TNF——或者抗-α4β7-整合素治疗的IBD患者的纵向粪便样本16s数据集代谢交互分析，特别是旨在验证我们之前从队列# 1中的发现,换句话说，与抗肿瘤坏死因子治疗的IBD患者临床效果相联系的硅预测和生态相互作用。事实上，在硅胶中对细菌相互作用的预测表明，胃肠道微生物生态学的差异取决于患者对抗TNF的缓解状态。与健康对照组相比，只有那些没有达到临床缓解的患者表现出明显的拮抗相互作用的减少和明显的资源竞争相互作用的增加。这两项发现与队列1的发现一致，表明无缓解期的IBD患者表现出肠道微生物生态系统紊乱(图5A)。此外与健康对照组相比，仅无缓解期的IBD患者的基线总预测代谢交换(即交叉喂养)已经降低了25% ± 5%(图5B，顶部面板;Mann-WhitneyU-test, p = 0.02)，而remitter患者IBD的预测代谢交换与对照组相似(图5B，下翼片;Mann-Whitneyu检验，p = 0.48)。为了排除任何可能影响预测代谢交换的先天混杂因素，我们在基线用临床、实验室和基于组织学的疾病标志物对肠道代谢交换进行了线性回归。我们不能观察到疾病活动的显著差异参数(HBI /Mayo基线,白细胞,c反应蛋白,病理学指数),这可能解释了缓解期和非缓解期患者之间不同的基线代谢交换。为了评估代谢交换紊乱是否明确归因于抗-TNF治疗或显示一个统一的临床疾病状态,我们调查了缓解和非缓解患者之间回应治疗诱导的抗α4β7-整合素抗体(vedolizumab)代谢相互作用比例。尽管缓解患者(n=11)和非缓解患者(n=2)的样本数量太小，不足以用有效的统计方法证实我们的发现，但我们的观察表明，vedolizumab的非缓解患者的微生物代谢交换紊乱也可能更明显。
7 微生物代谢物交叉喂养相互作用的硅荟萃分析预测了与IBD中抗肿瘤坏死因子治疗相关的特定代谢途径。
为了确定在IBD期间代谢物交叉喂养相互作用的紊乱，我们结合了1和2号队列中所有接受抗肿瘤坏死因子治疗的患者的16S rRNA数据进行硅荟萃分析。对374种代谢物预测的交叉喂养率进行主成分分析，既没有发现群体衍生的批量效应，也没有发现性别差异。从这些交叉喂养的相互作用中，我们推断，与健康对照组相比，非缓解患者的10个代谢物在基线时的交换频率较低。其中只有三种(乙醇、谷氨酸、甘氨酸)在获得临床缓解的患者中也可见到(图6，左维恩图)，这表明非缓解型IBD患者的代谢相互作用网络受到了更强的破坏。有趣的是，有硅分析预测抗TNF治疗后某些受影响代谢物(如丁酸盐)会恢复(图6，右维恩图)。总的来说，与获得临床缓解的患者(4个代谢物，图6)相比，IBD无缓解的患者在抗肿瘤坏死因子治疗后代谢相互作用(7个代谢物)受到更强的干扰。通过对来自缓解期和非缓解期患者的基线样本的直接比较，我们可以推断，与获得临床缓解的IBD患者相比(错误发现率校正Mann-WhitneyU-test, P = 0.02)，非缓解期患者中，丁酸盐的细胞间交换显著减少81%(中位数)。总的来说，这些结果支持了这样的假设，即对治疗本身的反应与治疗初期患者的代谢交换的流行密切相关。
图6:细菌之间的特定代谢物交换相互作用的破坏在IBD的非缓解患者中比在抗TNF治疗之前的缓解患者更明显。维恩图显示，与健康对照组相比，IBD患者在治疗过程中进入缓解期和/或未达到缓解期，其细菌群落成员之间的交流明显减少(左:治疗前;右:治疗后。错误发现率修正的双侧Mann-Whitney U检验，p < 0.05)。本研究将1号和2号队列中所有接受抗肿瘤坏死因子治疗的IBD患者合并进行分析，以提高统计学能力。
8 抗肿瘤坏死因子治疗的临床缓解与粪便代谢组的改变有关
讨论
代谢紊乱的定义是肠道菌群的多样性、组成和结构的改变，但导致代谢紊乱的潜在的代谢原理仍然知之甚少。最重要的是，抗TNF(肿瘤坏死因子)治疗是否会影响肠道微生物组成或功能，从而有助于IBD(炎症性肠病)的疾病控制，目前尚不清楚。在本研究中，我们以风湿病患者作为非肠道炎症对照队列，研究了IBD中治疗性抗肿瘤坏死因子抑制和肠道菌群功能的相互作用，并描述了器官特异性炎症(即肠道与非肠道)对宿主微生物相互作用的影响。
我们证实了与健康人相比IBD和风湿性疾病显示不同的改变微生物群落结构和代谢功能的特点，从而证实了先前从炎症性肠病和风湿性疾病的评估粪便全球微生物概况(α-和β多样性)的研究中的发现。虽然这些先前发表的研究使用了不同的技术和采样条件，但我们提供了一个完整的数据集，作为从相同的临床环境中收集的风湿性疾病和IBD患者的直接对比。
此外，我们应用了一种新的系统生物学方法，这是首次在IBD的背景下，允许我们评估微生物群落内代谢相互作用水平上的群落结构失调变化的功能后果。我们发现抗TNF治疗可诱导IBD患者肠道微生物多样性的恢复，而在风湿病患者中，抗TNF相关的变化不明显，且只是短暂的。
我们通过指标物种分析进一步分析了IBD和风湿病中抗TNF -相关的系统类型丰度的转移，并确定了疾病特异性的系统类型，这些疾病特异性的系统类型在抗TNF治疗IBD或风湿病的过程中丰度发生了变化。值得注意的是，我们既没有发现具体归因于抗肿瘤坏死因子治疗的临床疗效的指标种类，也没有证实之前报道的在基线时柔嫩梭菌群数量增加与治疗疗效之间的关系，这两者在我们的研究中可能都是小样本范围造成的。值得注意的是，已知的短链脂肪酸(SCFA)的产生者，其丰度在IBD患者中向健康受试者的方向显著改变(如粪球菌和菊泥菌)。
基于16S rRNA基因序列的交叉喂养分析来探究肠道代谢功能。这一分析的目的是确定代谢交叉喂养的相互作用，观察到了的治疗效果(缓解)中的丁酸盐的产生。在IBD中，我们使用两个独立的抗肿瘤坏死因子治疗队列，利用基于约束的模型评估社区内细菌之间的潜在代谢相互作用。我们发现，在IBD中出现代谢物交叉喂养相互作用的减少和资源竞争的增加。这种代谢相互作用在人体肠道菌群中广泛存在，被认为对健康状态下的群落稳定性和健壮性具有重要意义。虽然共生的和拮抗的相互作用可以稳定群落动态，从而有助于维持物种多样性，但种间资源竞争会降低群落稳定性。
此外，有人认为微生物群落中物种的共存在很大程度上是由细胞间的代谢交换驱动的。事实上，我们观察到抗TNF干预IBD可以恢复代谢物交换相互作用。更重要的是，我们发现，在抗肿瘤坏死因子治疗未能达到临床缓解的IBD患者中，细菌间的总代谢物交换已经在基线水平上显著中断。
最后，我们发现，在抗肿瘤坏死因子治疗效果不佳的患者中，丁酸盐和参与丁酸盐合成的底物，如乙醇或乙醛，在细菌群落中交换的频率较低。沿着这条思路，各种研究表明，干扰微生物网络中包含的分类单元典型的SCFA表现为常规治疗和生物治疗的失败。这些发现不仅支持SCFA在的IBD患者的疾病控制中的至关重要的作用，还预告了使用16 s生物信息学分析预测在IBD中断,可能会影响治疗效果的代谢途径的可行性,他人也这样认为。人们很容易推测生物疗法恢复IBD代谢物交换相互作用的作用机制。一个强大的临床反应的生物治疗导致粘膜愈合，在宿主转录组结构中诱导随后的变化。由于宿主转录组和肠道菌群之间的一致性受损已被描述为IBD的一个显著特征，我们假设用成功的生物疗法重建一致性也可能影响细菌间的种系相互作用和代谢物相互作用。
然而，在抗肿瘤坏死因子治疗的背景下，需要进一步详细描述黏液相关微生物群的变化及其与宿主转录变化的相互作用，以加深我们对宿主微生物相互作用及其诱导缓解作用的理解。综上所述，我们证明了抗TNF治疗可恢复IBD患者的肠道微生物组结构和改变疾病指标分类，我们还证明了在IBD患者中，管腔细菌之间特定的推测性代谢相互作用与治疗结果相关。与肿瘤免疫检查点抑制剂的研究相似，我们的研究明确提示了肠道微生物生态系统与TNF抑制治疗操作之间的功能联系。因此，有必要进一步研究分析微生物代谢相互作用网络作为潜在诊断标记物或可操作的切入点的确切作用，以积极改善IBD的治疗控制。
结论
抗TNF治疗使IBD患者粪便菌群多样性向对照组转移，但风湿病患者粪便菌群多样性未向对照组转移。在不同的时间点，IBD患者的多样性指数在治疗后是否达到临床缓解之间没有显著差异。相比之下，在模拟肠道微生物之间代谢相互作用的硅预测模型中发现，在IBD患者的粪便样本中，代谢物交换在基线时显著减少，并与后来的临床缓解相关。经粪便代谢组学分析证实，预测丁酸盐和丁酸合成物(乙醇或乙醛)的水平与抗肿瘤坏死因子治疗后的临床缓解显著相关。
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