技术贴 | 宏基因组专题 | 宏基因组分箱(Binning)技术
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宏基因组分箱（Binning）是将宏基因组测序得到的混合了不同生物的序列或序列组装得到的contigs按物种分开归类的过程，类似下图（图0）。传统的单物种全基因组序列都是经纯培养之后，再进行全基因组de novo测序才获得的，但是环境中存在着大量的不可培养微生物，宏基因组分箱技术有助于获得不可培养微生物的全基因组序列，获得新物种的基因组序列和功能，预测未知物种的培养方法等等。
【图0】
一、分箱工具盘点
早在2011年，science上的一篇文章就用了宏基因组Binning技术对来自牛瘤胃的样本进行了宏基因组测序研究。该研究从268 Gbp的宏基因数据中成功Binning出了15个不能培养的微生物的全基因组序列（可见分箱对数据量要求很大）。从那以后，宏基因组Binning技术开始被更多的人关注和重视，也逐渐出现了很多宏基因组Binning工具。查了一些文献和资料，我罗列了一下近几年的分箱工具，引用量仅供参考（google学术，2019.8.29）。
【表1】
二、分箱工具比较
2017年Nature Methods上一篇文章对宏基因组数据处理各个过程中的软件进行了评估[ Critical Assessment of Metagenome Interpretation-a benchmark of metagenomics software ]。从文章的分析结果来看，不同的方法各有优缺（下图），MaxBin2可能是相对较好的一个分箱软件。
比较结果：
【图1】
加利福利亚大学在通过整合多个算法设计出了新的Binning软件DAS tool并在2018年发表在Nature Microbiology上 [ Recovery of genomes from metagenomes via a dereplication, aggregation and scoring strategy ]。集合了多个算法的DAS tool各项Binning指数要明显优于CONCOCT，MaxBin 2，MetaBAT等方法，比较分析结果如下：
比较结果：
对模拟微生物群落进行基因组重建分析
【图2】
对不同样本来源的宏基因组数据进行分箱完成度分析
【图3】
同年，Microbiome上发表了另一个整合了多个工具的分箱分析流程MetaWRAP [MetaWRAP—a flexible pipeline for genome-resolved metagenomic data analysis. Microbiome]。
MetaWRAP流程不仅纳入了最流行的MetaBAT、CONCOCT和MaxBin2分箱方法，还整合了质控、拼接、分箱、提炼、评估、注释等多种功能。MetaWRAP可以解决分箱分析中可能遇到的绝大多数问题，而且比较分析发现综合多个工具的MetaWRAP分箱法不仅比单个工具分箱效果好，也比同样是综合多个算法的DAS tool分箱法效果好，比较分析结果如下：
比较结果：
完成度和污染度的比较（CAMI数据集）
【图4】
完成度和污染度的比较（水、肠道、土壤数据）
【图5】
metaWRAP重组装分箱效果更佳
【图6】
三、分箱实战
MetaWRAP集合的算法和工具很全很多，但是也很慢，有条件的话可以自己尝试使用MetaWRAP。考虑到时间，下面只以MetaBAT2为例简介分箱工作流程。
1. 准备
下面是需要的软件和数据：
1) MetaBAT2地址：
https://bitbucket.org/berkeleylab/metabat/src/master/
## 分箱工具
2) CheckM地址：
https://github.com/Ecogenomics/CheckM/wiki
## 分箱质检
3) 数据地址：
https://portal.nersc.gov/dna/RD/Metagenome_RD/MetaBAT/Software/Mockup/
## MetaBAT2测试数据
【图7】
## 下载得到已经组装好的contigs文件assembly.fa和两个样本的bam文件。
2. 统计contig深度
jgi_summarize_bam_contig_depths --outputDepth depth_var.txt *.bam
【图8】
第一列：contigName
第二列：contigLen
第三列：totalAvgDepth
第四列：library1.sorted.bam
第五列：library1.sorted.bam-var
第六列：library2.sorted.bam
第七列：library2.sorted.bam-var
3. 分箱 (4线程，21秒)
time metabat2 -t 4 -i assembly.fa -a depth_var.txt -o metabat2/bin –v
【图9】
4. 分箱评估 (4线程，32分钟)
time checkm lineage_wf -f metabat2/checkm.txt -t 4 -x fa metabat2/ metabat2/checkm/
## 评估结果保存在checkm.txt文件中。
grep 'bin' checkm.txt | sed 's/^ //' | awk '{print $1,$2,$13,$14}' | sed 's/\ /\t/g'| sed 's/\./\t/' | sort -n -k 2 | sed 's/\t/./' > test.txt
## 从checkm.txt提取ID，Taxonomy，Completeness，Contamination信息。
【图10】
第一列：Bin Id
第二列：Marker lineage
第三列：Completeness
第四列：Contamination
到此就完成了两个样本的宏基因组分箱和分箱评估工作。这只是宏基因组分箱的简介，更全更详细的分箱分析可以参考MetaWRAP分析流程。
地址：https://github.com/bxlab/metaWRAP/blob/master/Usage_tutorial.md
参考：
1） https://mp.weixin.qq.com/s/BHCs2Y97jXL-2kInlu49UA
2） https://blog.csdn.net/woodcorpse/article/details/83040987
3） http://blog.sina.com.cn/s/blog_9f23b9710102wu5t.html
感谢阅读~