编译：微科盟雪花飘飘，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
微科盟原创微文，欢迎转发转载。
导读
嗜酸乳杆菌NCFM是一种益生菌菌株，常用于乳制品和膳食补充剂。到目前为止，NCFM的体外后基因组研究已经将潜在的关键基因型与其益生菌相关属性联系起来，包括肠道存活、益生元利用、宿主相互作用和免疫调节活性。为了证实和扩展先前的体内和体外功能研究，作者采用了双RNA测序（RNA-seq）转录组学方法来鉴定可能在体内驱动嗜酸乳杆菌NCFM肠道适应性和活性的基因。同时，在单克隆化过程中检测其小鼠宿主的回肠转录反应。从回肠到结肠的NCFM空间表达谱显示了一组134个核心基因在肠道运输过程中持续过度表达。研究发现，这些体内核心基因主要参与碳水化合物、氨基酸和核苷酸的代谢，同时也参与肠道运输过程中的粘液结合蛋白和粘附因子的形成，证实了它们在营养获取和肠道滞留中的重要功能作用。高表达的主要编码基因的功能特性确定了其作为细胞形状决定因素和维持细胞表面完整性的不可或缺的作用，这对生存能力和益生菌属性至关重要。
原名：In Vivo Transcriptome of Lactobacillus acidophilusand Colonization Impact on Murine Host Intestinal Gene Expression
译名：嗜酸乳杆菌体内转录组及定殖对小鼠肠道基因表达的影响
期刊：mBio
IF：6.784
发表时间：2020.1.26
通讯作者：Yong Jun Goha & Todd R. Klaenhammer
通讯作者单位：北卡罗来纳州立大学
嗜酸乳杆菌NCFM在37°C的MRS肉汤（Difco）中静态繁殖。对于体外培养细胞的转录组测序，在MRS肉汤中培养NCFM，并在室温下以3220 g离心5至8 min，在中对数（600nm[OD600]；0.6的光密度）和固定相（16小时生长，OD600；3.5至4.0）下收集。用无菌129S6/SvEv小鼠（6只雄性，3只雌性；24至25周大）在北卡罗来纳州立大学（NCSU）的灵长类核心设施进行实验。小鼠被关在无菌柔性薄膜隔离器的笼子里，隔离器安置在一个光照和黑暗循环12小时的房间里，并提供标准饮食和自由饮水。定植研究设计和取样流程如图1A所示。制定了RNA分离策略和方案，以便从肠组织样本中回收高质量的细菌RNA，以及从肠组织中回收总RNA，用于下游RNA-seq和RT-qPCR分析。从肠组织中分离细菌RNA的优化方案包括预先从肠组织中物理分离细菌细胞，以尽量减少细菌RNA样本中宿主RNA的存在。这个步骤之后是细菌和宿主总RNA的平行纯化。简而言之，将十二指肠、空肠、回肠、结肠（每段约2 cm长）和盲肠（所有组织在收获后立即保存在RNATLATE试剂中）用无RNase镊子转移到无菌培养皿中，并纵向切割以暴露粘膜上皮。通过使用无菌一次性细胞刮刀轻轻刮除粘膜，可回收粘膜粘附细菌和管腔内容物。采用三试剂法分离纯化总RNA与Qiagen RNeasy Mini或RNeasy Plus Universal minikit结合使用，并进行DNA酶治疗。对于从肠段回收的嗜酸乳杆菌NCFM的转录组测序高质量的细菌RNA（基于生物分析仪分析）。
考虑到沿GIT纵轴的独特生理条件（例如pH、氧气、渗透压梯度、胆汁酸和抗菌肽），位于小肠和大肠的嗜酸乳杆菌NCFM的转录谱使作者能够检测到可能有助于嗜酸乳杆菌通过GIT的生态适应性的反应。向无菌129S6/SvEv小鼠施用嗜酸菌NCFM，并在第4天以5.79×108±8.23×107 CFU/g确认定植情况（图1A）。第7天处死小鼠，取肠段（十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠）进行RNA提取。从回肠、盲肠和结肠获得细菌总RNA，用于mRNA测序分析（见Dryad的表S1和S2，https://doi.org/10.5061/dryad.mcvdncjzr)。从十二指肠和空肠分离的细菌RNA产量太低，无法进行进一步分析，可能是由于该区域细菌密度较低和生理条件所致。首先，作者检测了体内转录的最高mRNA丰度，以检测对肠道存活和NCFM适应可能存在的重要基因或功能。图1B突出了回肠嗜酸乳杆菌NCFM中最高转录基因及其在其他取样条件下的相对表达水平。主要的S层基因slpA似乎是肠道中表达最高的基因（见Dryad的表S3，https://doi.org/10.5061/dryad.mcvdncjzr). 值得注意的是，先前与肠上皮细胞粘附和应激耐受的相关基因，例如聚集促进因子样蛋白、S层相关蛋白以及一些非特征性蛋白在体内高度表达。有趣的是，一组应激反应蛋白在体内也被高度上调，这些蛋白被预测可以应对一般应激、碱性休克/细胞膜应激、氧化应激和磷酸盐饥饿。这反映了一种不同于典型应激反应蛋白家族的应激适应模式，包括Clp蛋白酶和伴侣GroES GroEL和DnaJ-DnaK-GrpE，它们在MRS培养基中生长的固定相细胞和灌胃到小鼠（第0天）前在PBS中再悬浮的细胞中主导了最高转录的基因。此外，许多核糖体蛋白和糖酵解酶在体内被高度诱导，表明NCFM细胞在肠道内具有代谢活性。
图1嗜酸乳杆菌NCFM定殖研究和体内高表达基因的鉴定。
（A）对于小鼠定植实验设计，在研究前2天（第22天），通过在平板计数琼脂和MRS琼脂上有氧和厌氧培养粪便样本，验证9只无菌129S6/SvEv小鼠（24至25周龄）无菌。在实验开始日（第0天），从隔离器中取出三只无菌小鼠（未经NCFM治疗的对照组）并实施安乐死，从十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠中获取肠组织用于RNA分离。同时，在MRS肉汤中培养的固定相NCFM细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）（pH7.4）洗涤一次，再悬浮在PBS中，并通过灌胃给药给实验组的其余6只小鼠（约6×108cfu，200ml/只小鼠）注射。对于NCFM体外对照，从相同的PBS悬浮液中收集细胞小份进行RNA分离。在第4天、第5天和第7天收集所有六只喂食NCFM的小鼠的粪便样本，用于NCFM的平板计数，以评估肠道定植状态（见所有六只小鼠粪便细菌计数的插图散点图，小鼠1[M1]至M6）。在第7天，对所有6只小鼠实施安乐死，并如上所述采集组织隔室进行RNA分离。第7天采集的6份粪便样本的一部分也在MRS肉汤中培养，以进行元基因组测序。（B）从回肠分离的嗜酸乳杆菌NCFM的最高转录基因（前25位，按降序排列），盲肠和结肠中的表达水平，灌胃前PBS悬浮液中的表达水平，以及MRS培养基中的对数生长期和稳定生长期（分别为对数MRS和Sta MRS）。表明属于特定COG功能类别的基因。ECF：能量耦合因子。（C）NCFM的SEM图像显示了失活最高表达基因slpA对slpAB-slpX1（NCK1973B）双突变体的形态学变化的主要影响。突变细胞失去了物种定义的杆状结构，表现为紧密的螺旋或卷曲的杆状构象。扫描电镜图像分别以2500倍、7000倍和12000倍放大率拍摄。
S层是蛋白质或糖蛋白亚单位的单分子结晶层，形成古细菌和一些真细菌（包括一些乳酸杆菌）的最外层外壳。嗜酸菌NCFM有三个S层编码基因：slpA（lba0169；显性）、slpB（lba0175；沉默）和slpX（lba0512；辅助）。与实验室生长条件类似，slpA是体内表达量最高的基因，slpX也是肠道运输过程中转录水平最高的基因之一，这促使作者进一步探讨这种代谢昂贵的细胞表层在菌株NCFM中的基本作用。在先前的研究中，slpA的失活导致了染色体倒位，在NCFM突变体中，slpB主要代替slpA表达。在目前的研究中，构建一个slp缺失突变体（slpABX突变体）来研究S层的生物学意义是不成功的。作者随后产生了一个slpAB-slpX1双突变体（NCK1973B），其slpB和slpA连续失活。菌株NCK1973B的扫描电子显微镜（SEM）成像显示，突变细胞失去了笔直、均匀的杆状形态，呈现为盘绕或螺旋状（图1C）。此外，生长受损的NCK1973B还表现出对胆汁挑战、模拟胃液和高渗压的敏感性增加的特性（上述URL的图S2A和B）。这些观察结果转化为NCK1973B在体内的低存活率和S层在肠道转运中的潜在保护作用。嗜酸乳杆菌NCFM的基线转录谱是在口服灌胃前从PBS中再悬浮的固定相细胞中测量的（体外对照，代表测量体内定植后转录变化的初始/零时间点基线；图1A）。体内差异表达基因的最高数量（每百万标准化转录物变化2倍[TPM]，错误发现率[FDR]-调整P值，0.05）出现在盲肠的NCFM中（占基因组开放阅读框总数的796[41%]），其次是结肠（688[36%]）和回肠（519[27%]）（图2）。总的来说，体内大多数高度上调的基因严重偏向于功能类别，包括碳水化合物（G）、氨基酸（E）和核苷酸（F）代谢、转录（K）、复制和修复功能（L），以及许多未知蛋白质（R、S）和无同源蛋白质簇的蛋白质（COG）名称（图2B），后者包含大多数细胞表面蛋白质。
（A）回肠、盲肠和结肠中差异表达基因（DEG）的圆形基因组表示，表达值对应于NCFM染色体的折叠变化（GenBank登录号NC_）（环4至6）。一个核心上调基因集（134个基因）映射到染色体（环3，红圈）揭示了基因簇或基因组“热点”的存在，在体内条件下高度转录。与碳水化合物、氨基酸和蛋白质相关的上调基因在回肠人群的核苷酸转运和代谢表现在第7环。选定的关键基因特征在外环突出显示。使用CiVi工具（65）进行DEGs的基因组作图和可视化。（B）堆叠条形图，描述回肠、盲肠和结肠中差异调节基因的数量和功能分布COG分类（见面板C）。（C）Venn图显示了肠道生态位中差异表达基因的空间分布（左），进一步强调了条形图（右）中描述的核心基因的功能分布。Fos：fos利用；glg：糖原代谢；cel：纤维二糖利用；2CR：胆汁诱导双组分调节系统LBA1430-1431；raf：棉子糖利用；pur：嘌呤生物合成。一组267个基因（ORFeome的14%）被命名为“体内核心基因”，在沿着肠道运输的过程中在嗜酸乳杆菌NCFM中差异表达（https://doi.org/10.5061/dryad.mcvdncjzr)，分别占回肠、盲肠和结肠中微生物差异调节基因的51%、34%和39%（图2C）。有趣的是，一些核心诱导基因似乎集中在特定的染色体区域（例如，在复制起点附近的负链上）或编码在操纵子中（图2A，环3）。位于这些基因组热点或潜在肠道适应性基因组岛内的基因的共调节可能使NCFM对营养可用性和环境变化作出动态反应，这可能提供竞争优势，并反映NCFM对哺乳动物肠道的特殊适应，类似于在植物乳杆菌中观察到的。核心诱导基因主要由那些参与碳水化合物、蛋白质和核苷酸的运输和代谢的基因组成（图2C和3A），表明它们在宿主存活和营养获取中的关键作用。此外，诱导的其他核心基因是假定的表面粘附素、粘液结合蛋白和S层相关蛋白，它们可能参与宿主粘附和免疫调节功能（图3B）。其中包括五种依赖于排序酶的LPxTG细胞壁锚定蛋白，包括两种粘液结合蛋白（LBA1019和LBA1652）、一种假定的纤维蛋白原结合蛋白（LBA1496）和两种未知的表面蛋白（LBA1654和LBA1633）（图3B和2A）。编码LBA1652、LBA1496和LBA1654的基因先前在体外胆汁暴露时被发现过表达。LBA1633包含多个肋骨/α结构域拷贝（PF08428），也存在于其他乳酸杆菌的表面蛋白中，这些蛋白与宫颈和阴道上皮的粘附有关。我们先前的研究表明，在体内，sortase失活对NCFM菌株的肠道滞留有负面影响。这五种LPxTG锚定蛋白的诱导精确定位了这些特定的sortase依赖蛋白在GIT中NCFM与宿主相互作用的潜在作用。先前与棉子糖、水苏糖、低聚果糖（FOS）、聚葡萄糖、纤维二糖和糖原代谢利用相关的基因簇在肠道中持续上调（图3A）。诱导FOS、棉子糖和水苏糖分解代谢的基因可归因于这些不可消化的低聚糖在小鼠食物中的存在。作者首先报道了嗜酸乳杆菌NCFM中糖原代谢途径的生物学重要性，其中类似的途径也主要在通常与自然或哺乳动物宿主环境相关的乳酸杆菌中发现。失活的途径负面影响生长，碳利用能力，胆汁耐受性。更重要的是，在小鼠肠道内的竞争力NCFM。这种代谢途径在肠道转运过程中的持续上调进一步证实了糖原储存和碳循环对NCFM肠道适应性的意义。作为受体内定殖影响最大的基因的主要功能群，碳水化合物代谢基因在体内转运过程中的诱导似乎是肠道定殖乳酸杆菌（包括植物乳杆菌和约翰逊乳杆菌）的一种标志性表达模式。从头核苷酸生物合成和补救途径基因的过度表达（诱导核心基因的12%；图3A）突出了核苷酸生物合成在小鼠肠道定植中的重要性。在其他细菌中，合成核苷酸的能力是定植和致病的主要先决条件。一种主要的促进因子超家族（MFS）转运蛋白（LBA1429；图3A）及其相关的胆汁诱导操纵子先前与胆汁耐受有关，在体内一直受到调控。有趣的是，三种阳离子转运P型ATP酶也被上调（图3A）。P型ATPase家族的成员参与阳离子的易位以维持膜的电化学梯度，例如在碱性pH胁迫下，清除微量元素，以及有毒重金属的输出。
图3（A）在体内，嗜酸乳杆菌NCFM中的差异调节核心基因涉及碳水化合物[G]（左图）、氨基酸[E]、核苷酸[F]、脂质[I]和无机离子转运和代谢[P]（右图）。（B）回肠诱导的细胞表面蛋白基因及其在盲肠和结肠中的表达水平。诱导折叠变化对应于气泡的大小，向下调节的折叠变化用未填充的气泡来表示。Log2倍变化，回肠、盲肠或结肠中的差异表达率与口服灌胃前在PBS中再悬浮的固定相细胞（第0天的基线转录组，体外）。G3PDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；辅酶A，辅酶A。嗜酸乳杆菌NCFM的生态位特异性转录组的比较揭示了回肠群体特有的差异调节基因的一大子集（195/519或38%；图2C）。盲肠和结肠分别为150/796或19%和53/688或8%。回肠特异性基因约73%（142/195）参与氨基酸转运和代谢、转录调控、复制和重组以及功能未知的蛋白质。除了核心诱导基因组中的5种氨基酸和肽转运蛋白外，回肠中还有11种蛋白质转运系统被特异性上调。相反，在回肠中，10种预测的氨基酸从头开始的途径（丙酮酸到丝氨酸，LBA1397-1398；天冬氨酸到天冬酰胺，LBA1896）中只有2种被诱导。总之，这些发现强调了氨基酸和肽在小肠内获得的重要性。这些转运系统的上调可以清除这些逃避宿主吸收或在肠道环境中生理丰富的底物，例如谷氨酰胺。除了清除营养物外，值得注意的是，寡肽转运系统的OppA底物结合成分也通过与胆盐结合并阻止其进入细胞而与胆汁耐受有关。淀粉是老鼠饮食中主要的可消化碳水化合物成分，加工小麦和玉米是主要的食物成分。回肠中针对a-1,4-/a-1,6-葡萄糖苷（LBA1866-1867，LBA0264）和b-葡萄糖苷（LBA1575-1576，LBA1706-1707）底物的分解代谢机制优先上调，反映嗜酸乳杆菌NCFM从上消化道部分被宿主酶降解的淀粉成分中获取碳源的能力。这包括麦芽糖利用操纵子的ABC转运蛋白通透性，该操纵子在功能上与益生元异麦芽低聚糖、葡聚糖和麦芽三糖的代谢相关。一种推测的A-L-鼠李糖苷酶（LBA1473）也被特异诱导。纯化的嗜酸乳杆菌α-L-鼠李糖苷酶能水解植物类黄酮芦丁和柚皮苷中的鼠李糖苷。这种酶有可能使NCFM分解来自多酚的鼠李糖苷，这些多酚通常存在于膳食植物材料中。考虑到浮游生物生长期间未检测到显著的slpB表达，嗜酸乳杆菌NCFM的次级Slp基因slpB在回肠中的过表达是有趣的。在其他S层形成菌如弯曲杆菌和梭状芽孢杆菌中，S层转换在抗原变异和逃避宿主防御机制中起重要作用。NCFM中slp位点的基因组结构允许条件依赖的染色体倒位（转换）事件，以利于slpB代替slpA的表达。目前的转录组数据显示，在小肠，宿主免疫系统的主要部位，NCFM的一个亚群中存在S层转换。NCFM的SlpA通过直接与DC特异性ICAM-3非整合素（DC-SIGN）受体结合来调节DC和T细胞功能。当暴露于树突状细胞时，以SlpA为主的天然NCFM诱导产生IL-10并降低促炎细胞因子IL-12p70的产生。相反，仅表达slpB的slpA基因敲除株与DC的结合显著降低，并诱导细胞因子产生模式发生改变，特别是诱导IL-12p70、TNF-a和IL-1b。然而，slpA仍然是体内表达最高的基因，表明回肠中的大多数NCFM人群以SlpA为主。作者推测，表达slpB的NCFM亚群可能是由SlpA slpB的S层转换引起的，作为建立免疫耐受的机制。盲肠和结肠NCFM群体共有345个差异表达基因，这些基因在两个生态位中也受到显著的协调调控。总的来说，嗜酸乳杆菌NCFM在盲肠和结肠中的转录组图谱高度重叠，77%到89%的差异表达基因（包括体内核心基因）在两个生态位中共同调控（图2C）。考虑到盲肠在通过结肠之前可能是细菌负荷的上游贮存器，这些发现是出乎意料的，但似乎是合理的。共有上调基因的主要功能类别（345个基因中的44%）涉及糖PTS系统、糖酵解酶、细胞壁生物发生、细胞分裂和蛋白质翻译。这表明，与小肠相比，先前在盲肠中观察到的更高的肠腔和粘膜相关的NCFM细胞密度证明，NCFM细菌具有更高的代谢活性和复制能力。除了核心诱导基因组中的碳水化合物分解代谢机制外，还诱导了几个与益生元a-和b-葡萄糖苷分解代谢以及膳食植物糖苷与共轭植物化学物的生物转化（LBA0227和LBA0726）相关的PTS转运体和酶。与甘油摄取相关基因（LBA1436）的上调相一致，表明NCFM能够利用来自膳食甘油三酯的甘油作为细胞膜生物发生的能量源和前体。有趣的是，我们还观察到盲肠和结肠中脂磷壁酸（LTA）生物合成基因（LBA0445-0447）的特异性上调，表明这种免疫原性配体沿着肠道的空间来表达。同时进行宿主转录研究，以检测NCFM定植对肠组织表达的影响。首次对NCFM定植和无菌小鼠（n=3/组，2只雄性，1只雌性）的肠道组织样本进行逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析，以选定的免疫标记物和肠上皮屏障连接蛋白的表达为靶点。在NCFM定植小鼠中，IL-12b、OCLN和TJP1基因与无菌小鼠相比显著下调，仅在小肠区域表达（图4）。其他被测细胞因子的表达没有明显变化，表明嗜酸乳杆菌NCFM的定植并没有显著影响其生殖宿主的天然细胞因子谱。另一方面，嗜酸乳杆菌L36先前在无菌瑞士NIH小鼠中显示诱导IL-6和TNF-a因子，这意味着菌株的依赖性，也可能是宿主模型依赖性反应。本研究中IL-12b的下调可能提示NCFM与宿主上皮细胞相互作用产生抗炎反应。作者目前的研究显示在NCFM定植后OCLN和tjp1mrna表达减少，推测在NCFM单克隆小鼠中也发生了类似的情况。结构免疫组织化学和紧密连接蛋白表达的进一步研究证实了NCFM在恢复肠道通透性功能中的潜在作用。总的来说，小肠中显著的转录变化突出了这个区域作为NCFM调节宿主免疫和肠道屏障功能的主要效应位点。为了进一步研究NCFM定植对宿主小肠上皮细胞的影响，对同一NCFM处理组和无菌对照组小鼠的回肠组织进行mRNA-seq表达谱分析。检测到24个基因的差异调节≥1.5倍，两组之间具有统计学意义（FDR调整的P≤0.05），在NCFM定植小鼠中，分别有17个和7个基因上调和下调（表1）。众所周知，无菌小鼠的肠道生理功能受损，包括上皮细胞增殖和分化、绒毛血管生成受损、细胞更新率和伤口愈合率降低以及免疫系统不成熟等因素。值得注意的是，NCFM定植能够导致Tnfsf15的下调，Tnfsf15是一种促炎症细胞因子和凋亡介质（图5）。TNFSF15的下调可抑制下游NF-κB介导的炎症信号转导的反式激活级联反应。基于通路分析，Tnfsf15的抑制被预测为上游调节因子IL-10受体（IL10RA）激活的结果，从而抑制促炎细胞因子的产生。
