串联质谱联合二代测序在2万例新生儿遗传病筛查分析中的应用
目的
研究新生儿遗传代谢病(IMD)的发病率及诊断方法，并探讨串联质谱及二代测序技术在新生儿遗传病筛查中的应用价值。
方法
收集广东地区2013年6月至2019年6月出生的20 000例新生儿足跟血，采用串联质谱(MS/MS)进行检测并进行遗传代谢病分析，对质谱检测结果高度提示阳性及部分疑似样本进行基因测序分析，并对检测结果进行统计分析。
结果
20 000例新生儿(男10 584例，女9 416例)中通过MS/MS技术诊断IMD阳性40例，疑似样本45例，阴性样本19 915例(其中24例临床高度怀疑IMD)，进而对质谱检测阳性、疑似及临床高度怀疑IMD的109例样本进行基因测序分析，共检测出阳性病种17种共63例，阳性率0.315%，分别为有机酸血症25例，尿素循环障碍22例，氨基酸代谢病6例，脂肪酸氧化障碍4例，肝豆状核变性3例，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症2例，半乳糖血症1例。
结论
MS/MS是新生儿IMD快速有效的筛查方法，而二代测序则提供了明确的分子诊断，因此，基于MS/MS及二代测序技术可为新生儿IMD早期诊断和治疗提供依据。
遗传代谢病(IMD)又称先天性代谢缺陷，由于体内代谢酶、运载蛋白、膜蛋白或受体等编码基因发生突变，使得相关蛋白结构或功能变化，导致体内生化代谢紊乱，造成生化反应的前体、中间、旁路代谢产物蓄积或终末代谢产物缺乏而引起一系列临床症状和体征的一类疾病，包括氨基酸代谢障碍、脂肪酸氧化异常、有机酸血症等[1,2,3,4]。IMD单一病种发病率很低，1/万～1/1 000万，但该病种类繁多，迄今已发现超过1 000种，全球常见病种500～600种，因此群体发病率较高，约为1%甚至更高[5,6]，在出生缺陷疾病中占有重要地位。该类疾病对患儿危害严重，缺乏临床表现特异性，可累及全身各个器官尤其是神经及消化系统，可造成患儿严重智力障碍，甚至危及生命。早期诊治，特别是症状出现前的有效筛查，对IMD预后意义重大[2]。目前，我国通过串联质谱(MS/MS)筛查技术对未出现临床症状的遗传病患儿进行早期诊断和治疗，有效降低了患儿的伤残率和死亡率，极大地减少了出生缺陷对家庭和社会造成的严重危害，随着分子生物学技术和基因组学的飞速发展，二代测序技术已成为大多数遗传病的疾病诊断金标准，在IMD诊断中发挥重要作用[2,7,8]。本研究以20 000例新生儿为研究对象，探讨MS/MS及二代测序技术在新生儿遗传病筛查中的应用价值。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
广东地区2013年6月至2019年6月在中山大学附属第六医院和河源市妇幼保健院就诊的20 000例新生儿，其中男10 584例，女9 416例，纳入标准：(1)活产儿；(2)监护人同意行MS/MS筛查，阳性或怀疑IMD者同意进行基因检测并已签署检测知情同意书。本研究通过中山大学附属第六医院医学伦理委员会批准(批准文号：2019ZSLYEC-105)。
1.2 样本收集
(1)足跟血采集：在足跟靠近足跟1/3内或外侧消毒，使用采血针进行采血，血滴自然渗透滤纸，连续采集3个血斑，每个血斑直径>8 mm，且滤纸正反面完全充分渗透，以保证血浓度均匀一致且无渗血环。采血完毕后把血片平放在阴凉清洁地方进行自然晾干，同时避开紫外线、阳光照射及外源污染，干燥后的血片经检查合格后置于密封袋内，保存于2～8 ℃冰箱中待测；(2)基因标本采集：对血液检测提示阳性及疑似的新生儿收集外周血1～2 mL。标本均按照统一的标本收集流程和检测流程进行。
1.3 检测方法
(1)血串联质谱检测仪器为Waters超效液相色谱(I-class)串联质谱仪(Xevo-TQD)，采用琥珀酰丙酮和多种氨基酸、肉碱测定试剂盒进行非衍生化，干滤纸血片经打孔后加入含100 μL内标的萃取液(8∶2的甲醇∶超纯水)，放入微孔板震荡器以700 r/min、45 ℃条件下振荡45 min后，放入离心机4 000 r/min (离心半径为4 cm)离心5 min，取上清液75 μL放于96孔耐热V底板中，铝膜覆盖后上机检测，该检测通过电化学原理将被检测物质分子电离成质荷比m/s的带电粒子，并根据质荷比大小生成分离排列的图谱对离子峰的强度进行测定，串联质谱由2个质谱仪经1个碰撞室串联而成，来实现物质的定性和定量测定。(2)二代测序：利用DNA提取试剂盒(the QIA amp DNA Blood Midi Kit，产地：德国Qiagen公司)提取基因组DNA，利用Gene Cap基因序列捕获技术将常见的IMD致病基因的捕获探针和患儿的全基因组文库混合，其疾病相关基因片段被杂交至探针上，经洗脱处理将非目标区域的DNA片段洗掉，从而富集致病基因片段。利用Hiseq-2000(美国Illumina公司)测序仪，按照标准操作步骤对富集文库进行高通量测序。目标区域测序后经Trim-Galore程序过滤处理获得读数，保留读数质量>20和读取长度>80 bp的序列，运用BWA(Burrows Wheeler Aligner)软件与人基因组数据库(HGl9)比对，再采用GATK软件包对点突变、插入突变或缺失突变等进行收集。
2 结果
2.1 MS/MS筛查一般情况
2.2 MS/MS及基因验证结果
2.3 阳性IMD分类统计及基因变异情况
63例IMD阳性病例中，有机酸血症25例，尿素循环障碍22例，氨基酸代谢病6例，脂肪酸氧化异常4例，肝豆状核变性3例，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(G6PD)2例，半乳糖血症1例，疾病分类统计见表1，基因突变位点情况见表2。
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表1遗传代谢病阳性疾病分类统计
Table 1 The classification statistics of positive inherited metabolic disease
表2 阳性IMD基因突变统计
Table 2 Gene mutation statistics of positive IMD
3 讨论
IMD属于罕见病，包括氨基酸、脂肪酸、有机酸代谢病等，IMD可在新生儿期、婴幼儿期、儿童期甚至青少年期和成年期发病，且多数IMD临床表现并无特异性，常累及全身各个器官，尤其是神经及消化系统，如抽搐、昏迷、肌张力低下、酸中毒、电解质紊乱、高乳酸及高血氨等，更值得一提的是，不同病种可表现出相似的临床症状，而同一病种有可能因不同个体而表现出差异较大的表型[2,9]。此类疾病给患者及家庭带来了沉重的经济及精神负担，通过早期的诊断和治疗，尤其是在未出现症状前筛查对预后具有重要意义，因此新生儿IMD筛查至关重要。1990年，美国率先将MS/MS应用于新生儿疾病筛查，近年来，在国内越来越多的地区如上海、广州、浙江、广西等地区逐渐开展IMD筛查，这为IMD的筛查和诊断带来了革命性进展[10,11]。研究表明，我国自开展新生儿IMD筛查以来，在预防疾病、挽救生命、改善预后等方面取得了显著的成绩，值得一提的是，随着基因测序技术的发展，对新生儿进行目标基因测序筛查已成为可能，这将是IMD筛查的重要发展方向和领域[2]。IMD发病率不同国家差异很大，据报道，世界各地IMD的总发病率为1∶13 205～1∶1 178[12,13,14,15,16]。本研究利用该技术结合基因测序技术进行新生儿IMD检测20 000例，确诊了63例，总阳性率为0.315%，高于上述文献[12,13,14,15,16]报道，其原因之一可能是筛查样本量少，之二是本院开设遗传代谢病门诊，部分患儿是在出现了类似IMD症状后来中山大学附属第六医院进行就诊，比较具有针对性，因此总体阳性率偏高。
MS/MS提示阳性的40例患儿，经二代测序验证，其中39例均得到了基因验证，表明MS/MS进行IMD筛查具有较高的特异性和灵敏度，仅1例外显子测序验证为阴性，该病例MS/MS多次检测均发现丙酰内碱(C3)、C3/游离肉碱(C0)、C3/乙酰肉碱(C2)、C3/棕榈酰肉碱(C16)、C3/甲硫氨酸(Met)均特异性升高，且C3高于上限值达5～10倍，其尿有机酸检测发现3-羟基丙酸、甲基枸橼酸也特异性升高，且临床反复发作酮症酸中毒，因此基于质谱结果及临床表现，均支持该病例为丙酸血症，产生此种差异性，其原因之一可能与外显子测序在技术层面的局限性所导致，如不完整的测序覆盖率，即富含高嘧啶和鸟嘌呤难以测序，原因之二可能是外显子测序只检测了编码区，而非编码区，如内含子，可能会与该基因致病相关，原因之三可能是未知的致病基因导致的丙酸血症，本研究将持续跟踪该病例情况，期待新的发现。
MS/MS提示疑似的45例患儿，经二代测序验证22例为阳性，23例为阴性，表明MS/MS技术在IMD检测中也具有一定程度的假阳性率。假阳性的出现一方面与MS/MS局限性相关，如检测结果容易受孕周、新生儿体质量及营养情况等个体因素的影响，且该仪器价格昂贵，维护费用相对较高，必须有熟练的技术人员配备，因此其结果需临床医师综合分析，另一方面与代谢本身相关，如肝肾功能异常、药物治疗、饮食及其他非代谢性疾病的影响也会引起继发性或一过性的代谢紊乱。母源性肉碱缺乏母乳中游离肉碱水平低，从而新生儿血中水平也降低，其他原因，如营养不良、长期素食、反复呕吐、腹泻、早产、严重感染、重大手术或其他疾病消耗肉碱所致等也能够导致继发性游离肉碱及其他酰基肉碱轻度降低。Campbell等[17]指出，母亲长期素食或其他原因，如维生素B12缺乏及酸中毒可引起新生儿血浆C3升高。Arnold等[18]报道健康新生儿3-羟基异戊酰肉碱(C5-OH)继发性轻度升高是由于其母亲是3-甲基巴豆酰基辅酶甘氨酸尿症患者。外源性用药如丙戊酸、新戊酸、头孢噻肟等会引起一种或多种酰基肉碱的非特异性改变，使用头孢类抗生素可使得异戊酰基肉碱C5继发性升高[19]，饮食因素如补充三庚酸甘油，会引起血浆中奇数碳链的酰基肉碱C3、C5和C7升高，使用左卡尼汀或喂养富含左卡尼汀的奶粉会继发性引起血检C0升高等。
MS/MS提示阴性的24例病例，基因验证发现22例为阴性，2例为阳性，说明MS/MS筛查IMD也会有一定的假阴性率。其中1例阳性病例为原发性肉碱缺乏症，分析其原因为游离肉碱能通过胎盘从母体转运给胎儿，母体内肉碱储备充足，且新生儿出生后使用富含左卡尼汀奶粉可导致新生儿筛查时容易出现假阴性；另1例阳性病例为Citrin缺陷症，分析其原因该病MS/MS阳性指标瓜氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和精氨酸水平升高，受基因变异位点和饮食影响较大，容易表现为一过性，尤其是新生儿出生后给予无乳糖水解蛋白奶粉喂养时，上述指标可在短时间内恢复至正常范围，且该病所涉及的临床表现和实验室检测异常，部分轻度患者在4～6月龄后将渐渐趋于正常，因此建议各项检测应在4月龄前进行。
近年来IMD筛查结果表明，在IMD高危患儿中甲基丙二酸血症和Citrin缺陷症导致的婴儿肝内胆汁淤积症阳性率较高，与文献[20]相一致，本研究发现阳性病例最多的分别是甲基丙二酸血症和Citrin缺陷症。甲基丙二酸血症根据致病机制分为单纯性甲基丙二酸血症和合并型甲基丙二酸血症2种类型，合并型中cblC型为我国主要类型[21]。本研究发现单纯性和合并型甲基丙二酸血症病例数相近，可能与样本量少有关。MMACHC基因即cbl C型突变的患者对维生素B12治疗多数有效，而MUT基因突变者绝大多数对维生素B12效果欠佳，其余突变者对维生素B12部分有效，根据基因突变分析报道，中国MMACHC热点致病突变为c．609G>A[22]，而本研究中4例甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症病例中，仅有1例出现了c.609G>A突变。此外，文献报道中在南方较常见的c.1280G>A在本研究中也未检出[23]。Citrin缺陷病是位于线粒体内膜上的载体蛋白Citrin的异常引起的先天性代谢性疾病，其致病基因是SLC25A13，中国人常见的SLC25A13基因突变类型依次为c.852_855delTATG，IVS6＋5G>A，1 638＋1 660 dup和IVS16ins3kb，这4种类型占总突变的83%[20]，本研究在15例Citrin缺陷病例分析中，12例检出了c.852_855delTATG突变，其余3例携带的变异类型不是中国人群常见的变异类型，该病早期治疗效果好，饮食管理是治疗的基础，需停用母乳改食用无乳糖水解蛋白奶粉并辅助对症治疗。
综上，MS/MS技术应用于新生儿IMD筛查，灵敏度与特异度非常高，是诊断新生儿IMD的快速有效方法，二代测序则有效降低了MS/MS的假阳性和假阴性率，明确了致病病因，为临床医师提供可靠的分子检测结果，有效地为后续的临床治疗和遗传咨询提供依据。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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