一天两登《柳叶刀》子刊，火遍全网的RET突变究竟是啥丨奇点深度
奇点糕想先问一个问题：有多少人之前听过转染重排（RET）激酶这个词呢？
不管听没听过，都可以看看《柳叶刀》来补课。最近《柳叶刀-肿瘤学》和《柳叶刀-糖尿病与内分泌学》同一天刊文，介绍了新型靶向药普拉替尼（pralsetinib），精准治疗RET变异非小细胞肺癌（NSCLC）和甲状腺癌的ARROW临床研究。
这种高规格的报道待遇，也说明RET基因变异是当前癌症靶向治疗的新热点，那么问题紧接着就来了：RET基因功能是什么？为什么会发生RET基因变异？RET基因变异是如何导致癌症发生的？且听奇点糕一一分解。
RET基因是如何被发现的？
RET基因的发现，是在1985年由哈佛大学医学院的三位科学家完成的，他们使用DNA转染法，以人T细胞淋巴瘤DNA转染小鼠的NIH-3T3细胞。如果转染后有此前尚未发现的新“集落”形成，就提示可能激活了新的癌基因。
Ras家族的多个基因，就是这样被发现的[1]。哈佛团队在研究中发现，被转染诱导形成的新基因，包含两个在正常人体细胞或淋巴瘤细胞内，原本不连接在一起的DNA片段。
下图中F条带即为经转染发现的RET重排基因，与正常人肾脏细胞DNA（条带e、J）或淋巴瘤细胞DNA（条带d、i、m）相比，这个条带缺少长度>16kb的DNA片段，提示可能发生了内部缺失，或不相连DNA片段的重组。
F条带与肾脏细胞或淋巴瘤细胞DNA存在明显区别，如不存在6.3Kb/2.3 Kb处的Eco RI片段，却与转染后的NIH3T3细胞DNA（b、c、g、h）条带更接近
（图片来源：Cell）
此后研究证实[3]，RET基因是一种能促进癌细胞增殖和存活的原癌基因，但它真正被重视是在2011年底，韩国研究团队最早报告了一例检出KIF5B-RET融合的NSCLC患者[4]。
肺癌患者的群体之庞大，远远不是之前RET基因变异比较多见的甲状腺癌、多发性内分泌腺瘤病2型（MEN2）等癌症能比的，这使得相关的科研探索和药物研发瞬间加速，也让科学界对RET基因有了更多的了解。
正常机体内，RET基因都在做什么？
RET基因位于人类的10号染色体长臂上，在胚胎发育期它对器官生成、神经发育等过程有重要的作用[5-6]，有研究显示敲除RET基因的小鼠出生1天后，就会因为肾脏不发育和先天性巨结肠死亡[7]。而在成年人体组织内，RET基因主要在肾上腺髓质、甲状旁腺、小脑、外周血单核细胞等位置表达[8-9]，但对机体功能影响相对胚胎发育期较小，如特异性敲除中脑多巴胺神经元的RET基因，可能会对其长期生存有一定影响[10-11]。
总而言之，正常的RET基因在胚胎发育期的生理意义相对较大，在成年人体内影响有限。一般情况下RET蛋白的活化需要依赖其配体——神经胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）家族受体（GFLs），但GFLs并不直接结合到RET蛋白上，而是先结合GDNF家族受体α-共受体（GFRα1-4），形成配体-共受体复合物。
配体-共受体复合物再结合到RET蛋白上，介导RET同源二聚体（Homodimer）形成，然后经胞内结构域磷酸化（autophosphorylation）完成活化，活化的RET蛋白能够激活Ras/ERK、PI3K/AKT等信号通路促进细胞增殖，从而在器官发育和组织稳态中发挥作用。
RET蛋白正常的活化过程
（图片来源：Nature Reviews Cancer）
RET基因变异是怎么促癌的？
如果出现融合（RET fusion，又称RET重排/RET rearrangement）、点突变等促癌变异时，RET蛋白会发生不依赖配体的异常过度激活。例如MEN2A中常见的RET错义突变，往往发生在细胞外富含半胱氨酸的结构域，使RET蛋白不结合配体就形成同源二聚体并活化（如下图b所示）。
RET促癌变异时的活化过程，与正常活化过程的对比
（图片来源：Nature Reviews Endocrinology）
RET基因点突变还可能发生在细胞内的激酶结构域，例如MEN2B型中最常见的M918T突变，活化RET蛋白就不需要形成同源二聚体，而是通过增强RET蛋白与ATP的亲和力，并使RET的活化单体更加稳定，激活下游信号通路促癌的（如上图c所示）[12]。
而在发生RET融合时，虽然RET基因细胞外的结构域会丢失，但KIF5B、CCDC6等伴侣基因往往带有卷曲螺旋结构域（coiled-coil domain），其会在新蛋白中诱导同源二聚化过程，从而使RET激酶结构域不依赖配体就持续激活促癌（如上图d所示）[13]。
NSCLC、甲状腺乳头状癌（PTC）中，最常见的RET基因促癌性变异是RET融合，而甲状腺髓样癌（MTC）、MEN2中较常见的则是体细胞/生殖细胞点突变[14]。其中RET融合的发生相对复杂，也是近年来科研探索的重点，那么导致基因融合的机制是什么呢？
RET融合的发生机制是怎样的？
机体受到各种内源性/外源性因素的刺激，细胞内的DNA每时每刻都可能出现损伤，其中DNA双链断裂是最严重的损伤之一[15]，会直接威胁细胞的生存，细胞内有两条修复通路用来减少DNA复制错误和损伤，分别是同源重组修复（HR）和非同源末端连接（NHEJ）。
HR通路属于“慢工出细活”式的精准修复，而NHEJ就有点不管三七二十一，先把DNA双链连上再说，这样修复就可能导致染色体的基因重排，使融合基因出现。
2014年日本学者对14例检出RET融合的肺腺癌患者进行分析，发现这些患者RET基因断裂的位点，基本都位于11号内含子（intron 11）上，而且一大半都是NHEJ机制修复的结果，最终表现为RET基因的3’端激酶结构域，和KIF5B等基因发生了融合[16]。
NHEJ对KIF5B、RET基因断裂的异常修复，导致KIF5B-RET融合发生
（图片来源：Journal of Thoracic Oncology）
除NHEJ修复外，RET或伴侣基因出现DNA单链断裂，引发的断裂诱导复制（BIR）也可能参与了RET融合的发生[16]。在结直肠癌等癌症中，还有研究报告了位于7号、10号内含子等较罕见的RET融合断裂位点[17-18]。
而辐射则是RET融合发生的已知危险因素，有学者分析了曾在切尔诺贝利核事故区居住的26例PTC患者，其中15例就检出了RET融合[19]，远高于正常环境下PTC患者中RET融合7-20%的发生率[20]。
不同种类的癌症中，与RET基因融合的“伴侣基因”也不同，NSCLC中大多数都是KIF5B，而PTC中以CCDC6、NCOA4为主，此外还有几十个基因可能与RET融合，这些伴侣基因对RET融合肿瘤生物学行为的影响，还有待进一步研究。
RET点突变/融合的具体促癌机制都还没有被彻底阐明，但目前认为这两种变异都会强力激活下游的PI3K/AKT、RAF/MEK/ERK等信号通路，延长细胞生存、促进细胞增殖，还会增强侵袭性并促进新生血管生成[14]。
RET基因变异或能调节免疫微环境
被促癌性基因变异或GFLs激活后，RET还会诱导促炎性蛋白，如细胞因子、趋化因子及相应受体的表达，这些促炎性蛋白可能直接作用于肿瘤细胞或肿瘤微环境，促使肿瘤相关炎症发生。
RET活化诱导的促炎性蛋白表达，还可能招募更多淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等免疫细胞向肿瘤浸润，这些免疫细胞也有一定水平的RET表达，从而可能在GFLs的激活下，参与促癌增殖和侵袭性转移的过程[21]。已有研究提示在MEN2中，对应类型的RET突变会导致抑制性肿瘤微环境，从而不利于免疫治疗[22]。
RET基因变异对免疫微环境影响的可能机制
（图片来源：Frontiers in Physiology）
2021年美国NCCN非小细胞肺癌临床实践指南中，也将RET融合列为可能导致免疫检查点抑制剂治疗缺乏获益的原癌基因之一，与EGFR、ALK等驱动基因并列，不过这是否与免疫微环境的改变相关，还需要更多研究探索[23]。
该如何找到RET变异的患者？
从发生频率来说，RET基因变异是不折不扣的罕见突变：2017年美国学者分析了39种组织学类型不同癌症，共4871例肿瘤组织样本的测序结果，其中只有88例检出了RET基因变异，包括34例点突变、27例融合和22例扩增，整体的检出频率为1.8%[20]。
RET基因异常的检出率和类别分布
（图片来源：Clinical Cancer Research）
而如果具体到癌症类型的话，RET融合在PTC和NSCLC中的检出频率，分别约为5-10%和1-2%，在其它癌症中都极其罕见[18]；而在较多见RET点突变的MTC患者中，报告的检出率在43-90%不等[18,20]。
一些真实世界大样本分析则显示，RET融合NSCLC患者一般有着年轻、不吸烟、组织学类型非鳞癌等特点[24-26]，与ALK融合等罕见突变的患者相似，可以对这类患者重点开展二代测序（NGS），争取找到RET融合等有药可用的突变。
在NSCLC治疗已经全面进入精准化、个体化时代的今天，以基因检测结果指导用药已经不是稀罕事。哪怕是RET基因变异这样相对罕见的位点，也应该纳入到必须检测的基因范围，从而为患者找到改善治疗结果的机会。
我国2021年版《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南》，就将RET基因的检测内容纳入其中，而6月份最新的《中国非小细胞肺癌RET基因融合临床检测专家共识》发布，能够进一步指导临床将RET检测实践规范化 [27-28]。
从发现RET融合肺癌患者，到有特异性的抑制剂可用，十年也不过是弹指一挥间。而在有药可用的同时，也需要遵循指南和共识，树立对RET基因的检测意识。医生积极检测，患者主动配合，才能真正让RET基因变异的靶向治疗走上快车道。
参考文献：
1.Cox A D, Der C J. Ras history: The saga continues[J]. Small GTPases, 2010, 1(1): 2-27.
2.Takahashi M, Ritz J, Cooper G M. Activation of a novel human transforming gene, ret, by DNA rearrangement[J]. Cell, 1985, 42(2): 581-588.
3.Jhiang S M. The RET proto-oncogene in human cancers[J]. Oncogene, 2000, 19(49): 5590-5597.
4.Ju Y S, Lee W C, Shin J Y, et al. A transforming KIF5B and RET gene fusion in lung adenocarcinoma revealed from whole-genome and transcriptome sequencing[J]. Genome Research, 2012, 22(3): 436-445.
5.Costantini F, Shakya R. GDNF/Ret signaling and the development of the kidney[J]. Bioessays, 2006, 28(2): 117-127.
6.Taraviras S, Marcos-Gutierrez C V, Durbec P, et al. Signalling by the RET receptor tyrosine kinase and its role in the development of the mammalian enteric nervous system[J]. Development, 1999, 126(12): 2785-2797.
7.Schuchardt A, D'Agati V, Larsson-Blomberg L, et al. Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret[J]. Nature, 1994, 367(6461): 380-383.
8.Takaya K, Yoshimasa T, Arai H, et al. Expression of the RET proto-oncogene in normal human tissues, pheochromocytomas, and other tumors of neural crest origin[J]. Journal of Molecular Medicine, 1996, 74(10): 617-621.
9.Rusmini M, Griseri P, Matera I, et al. Expression variability and function of the RET gene in adult peripheral blood mononuclear cells[J]. Journal of Cellular Physiology, 2014, 229(12): 2027-2037.
10.Jain S, Golden J P, Wozniak D, et al. RET is dispensable for maintenance of midbrain dopaminergic neurons in adult mice[J]. Journal of Neuroscience, 2006, 26(43): 11230-11238.
11.Kramer E R, Aron L, Ramakers G M J, et al. Absence of Ret signaling in mice causes progressive and late degeneration of the nigrostriatal system[J]. PLoS Biol, 2007, 5(3): e39.
12.Wagner S M, Zhu S J, Nicolescu A C, et al. Molecular mechanisms of RET receptor-mediated oncogenesis in multiple endocrine neoplasia 2[J]. Clinics, 2012, 67: 77-84.
13.El Osta B, Ramalingam S S. RET Fusion: Joining the Ranks of Targetable Molecular Drivers in Non-Small Cell Lung Cancer[J]. JTO Clinical and Research Reports, 2020: 100050.
14.Subbiah V, Yang D, Velcheti V, et al. State-of-the-art strategies for targeting RET-dependent cancers[J]. Journal of Clinical Oncology, 2020, 38(11): 1209.
15.Jeggo P A, Lobrich M. DNA double-strand breaks: their cellular and clinical impact?[J]. Oncogene, 2007, 26(56): 7717-7720.
16.Mizukami T, Shiraishi K, Shimada Y, et al. Molecular mechanisms underlying oncogenic RET fusion in lung adenocarcinoma[J]. Journal of Thoracic Oncology, 2014, 9(5): 622-630.
17.Le Rolle A F, Klempner S J, Garrett C R, et al. Identification and characterization of RET fusions in advanced colorectal cancer[J]. Oncotarget, 2015, 6(30): 28929.
18.Belli C, Penault-Llorca F, Ladanyi M, et al. ESMO recommendations on the standard methods to detect RET fusions and mutations in daily practice and clinical research[J]. Annals of Oncology, 2021, 32(3): 337-350.
19.Ricarte-Filho J C, Li S, Garcia-Rendueles M E R, et al. Identification of kinase fusion oncogenes in post-Chernobyl radiation-induced thyroid cancers[J]. The Journal of Clinical Investigation, 2013, 123(11): 4935-4944.
20.Pozdeyev N, Gay L M, Sokol E S, et al. Genetic analysis of 779 advanced differentiated and anaplastic thyroid cancers[J]. Clinical Cancer Research, 2018, 24(13): 3059-3068.
21.Mulligan L M. GDNF and the RET receptor in cancer: new insights and therapeutic potential[J]. Frontiers in Physiology, 2019, 9: 1873.
22.Castellone M D, Melillo R M. RET-mediated modulation of tumor microenvironment and immune response in multiple endocrine neoplasia type 2 (MEN2)[J]. Endocrine-Related Cancer, 2018, 25(2): T105-T119.
23.NCCN Guidelines Version 4.2021, Non-Small Cell Lung Cancer.
24.Zhang K, Chen H, Wang Y, et al. Clinical characteristics and molecular patterns of RET-rearranged lung cancer in Chinese patients[J]. Oncology Research Featuring Preclinical and Clinical Cancer Therapeutics, 2019, 27(5): 575-582.
25.Hess L M, Han Y, Zhu Y E, et al. Characteristics and outcomes of patients with RET-fusion positive non-small lung cancer in real-world practice in the United States[J]. BMC Cancer, 2021, 21(1): 1-12.
26.Lee J, Ku B M, Shim J H, et al. Characteristics and outcomes of RET-rearranged Korean non-small cell lung cancer patients in real-world practice[J]. Japanese Journal of Clinical Oncology, 2020, 50(5): 594-601.
27.中华医学会病理学分会,国家病理质控中心,中华医学会肿瘤学分会肺癌学组,等. 非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南（2021版）[J]. 中华病理学杂志, 2021, 50(4): 323-332.
28.中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会分子病理协作组,中华医学会病理学分会分子病理学组,国家病理质控中心. 中国非小细胞肺癌RET基因融合临床检测专家共识[J]. 中华病理学杂志, 2021, 50(6): 583-591.
本文作者 | 谭硕