外源基因在真核细胞表达技术方法

　　一、生化方法

　　1、磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞

　　（1）转染前24 h，通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以1×105至4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于60 mm组织培养皿或12孔板上。于含5%～7% CO2的37℃温箱孵育20～24 h。转染前1 h换液。

　　（2）按照下属方法制备磷酸钙-DNA沉淀：于5 ml灭菌塑料管内混合100μl 2.5 mol/L CaCl2与25μg质粒DNA，如有必要用0.1×TE（pH7.6）将体积补至1 ml。室温下将以上2×钙-DNA溶液与等体积的2×HEPES盐溶液混合。迅速弹敲试管侧壁混匀溶液，静置1 min。

　　（3）立即将磷酸钙-DNA悬液转移至上述单层细胞的细胞培养基中。每1 ml培养基加0.1 ml悬液。轻轻摇动平皿混匀培养基，培养基会变成混浊的橘黄色。一旦形成DNA沉淀，转染效率会大大降低，因此此步动作应尽可能迅速。如果是用氯喹、甘油与/或丁酸钠处理细胞，直接进行步骤5。

　　（4）如果转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含5%~7%CO2的37℃温箱孵育。2～6 h后，吸去培养基与DNA沉淀。加入5 ml 37℃预热的完全培养基，将细胞放回孵箱孵育1～6天。继续步骤6检测转染DNA的瞬时表达，或者如果是稳定转化则直接进行步骤7。

　　（5）在磷酸钙-DNA沉淀物的存在下用氯喹处理细胞或者吸去沉淀溶液后将细胞暴露于甘油与丁酸钠中会促进细胞吸收DNA。

　　2、用氯喹处理细胞

　　氯喹是一种弱碱，推测是通过抑制细胞内溶酶体水解酶降解DNA而发挥作用（Luthman and Magnusson 1983）。细胞对氯喹毒性的敏感度限制了培养基中加入氯喹的浓度及时间，不同细胞所需氯喹最佳浓度根据经验而定。

　　（1）在把磷酸钙-DNA沉淀物加入细胞前或后按1：1000将100 mmol/L氯喹直接加入培养基中。

　　（2）细胞于含5%~7%CO2的37℃温箱中孵育3~5 h。

　　（3）在用DNA于氯喹孵育细胞后，移去培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，加5 ml预热的完全培养基。细胞于孵箱中培养1～6天。继续步骤6检测转染DNA的瞬时表达，或者直接进行步骤7以获得稳定转化子。

　　3、丁酸钠处理细胞

　　丁酸钠的作用机制并不确定；但它是组蛋白乙酰化形成使外来质粒DNA趋于转录的染色质结构（Workman and Kingston 1998）。

　　（1）甘油休克处理后，将500 mmol/L丁酸钠直接加入生长培养基（甘油处理的步骤d）。细胞类型不同，所用丁酸钠的浓度也不同。例如：

　　CV-1           10 mmol/L

　　NIH-3T3         7 mmol/L

　　HeLa            5 mmol/L

　　CHO            2 mmol/L

　　其他细胞系所需浓度依经验而定。

　　（2）细胞于孵箱中培养1~6天。继续步骤6检测转染DNA的瞬时表达，或者直接进行步骤7以获得稳定转化子。

　　（3）若要检测细胞转染后导入DNA的瞬时表达，可在转染后1~6天收获细胞。杂交分析DNA或RNA。通过体内代谢标记进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。

　　（4）分离稳定转染体

　　用非选择性培养基孵育细胞24~48 h，使转染的DNA有足够时间表达。

　　胰酶消化细胞并重铺细胞于选择性培养基中，或者直接加选择性培养基/

　　每2~4天更换培养基，持续培养2~3周，目的是清除死细胞残骸，促进抗性细胞生长。

　　克隆独立菌路、繁殖，以用于检测（方法见Jakoby and Pastan 1979或Spector et al. 1998b [《细胞试验手册》的第86章]）。

　　用预冷的甲醇固定细胞15 min，然后室温下用10% Giemsa染色15 min，流水冲洗，这样可以记录细胞克隆数目。

　　二、物理方法

　　1、电穿孔转染DNA

　　（1）细胞生长到对数中期或晚期时收集细胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶释放贴壁细胞。4℃、500g离心5 min（Sorvall H1000B转子用1 500r/min）.

　　（2）用0.5体积的初始培养基重悬细胞，用血细胞计数器计细胞数目。

　　（3）离心（同步骤1）收集细胞，室温下用培养基或磷酸盐缓冲液重悬细胞至2.5×106~2.5×107细胞/ml。

　　（4）将400μl的各等份细胞悬液（106～107细胞）加入标记好的电转化池中，冰浴。

　　（5）设置电转化参数。一般电容量为1050μF。电压在200 V和250 V之间，不同细胞系所需电压不同，平均为260 V。内部阻抗设为无穷大。进行电穿孔前先用一个装有PBS的电转化池放电至少两次。

　　（6）每一装有细胞的电转化池内加入10～30μg、体积最大可至40μl的质粒DNA。用吸管将DNA与细胞轻轻混匀。立刻继续进行第7步。

　　（7）立即将电转化池移至电极间放电，1～２min后，取出电转化池，水浴，立即进行下一步操作。

　　（8）用带有高压灭菌吸头的微量移液器将电穿孔的细胞转移至35 mm培养皿中。用等体积的培养基洗涤电转化池，洗液加入培养皿。培养皿置于含5%～7% CO2的37℃孵箱。

　　（9）重复第6～8步，电转化所有DNA与细胞样品。记录下每一电转化池的实际脉冲时间以便于比较。

　　（10）如要获得稳定转化体，直接进行第11步。如果是瞬时表达，则于电穿孔24～96 h后用下述方法之一检测细胞：

　　如果使用的是表达E.coli β-半乳糖苷酶的质粒DNA，检测细胞裂解液中酶活性。

　　如果使用绿色荧光蛋白表达载体，在450~490 nm光照下用显微镜检测细胞。

　　如果使用其它基因产物，则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。

　　（11）分离稳定转染体：用完全培养基培养48~72 h后，胰酶消化细胞，用适当的选择性培养基重铺细胞。每2~4天换液一次，持续2~3周，目的是去除死细胞残骸，并允许抗性细胞克隆生长。