科研 | Nature子刊：哮喘高危患儿肠道菌群发育迟滞可通过补充乳酸杆菌暂时改善（第六期投票选出来的文章）
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婴儿期肠道菌群失调和代谢紊乱先于儿童共济失调和哮喘的发展。通过检测哮喘高危婴儿（HR）出生后第一年肠道微生物群的成熟情况，以及是否可以通过补充早期乳酸菌来改变。从HR婴儿中收集的粪便样本进行纵向比较，这些样本随机分为每日口服鼠李糖乳杆菌GG 组(HRLGG)或安慰剂组(HRP) 6个月，以及健康婴儿组(HC)。HRP组婴儿胎粪中的微生物群发育明显延迟，主要为糖酵解型，在6个月大时已耗尽一系列抗炎脂质。这些缺陷在HRLGG婴儿中得到了部分纠正，但这种效果在停止补充后6个月，即12个月大时就消失了。因此，本研究发现在HR婴儿中早期肠道微生物发育是明显的，但具有可塑性，为早期干预提供了一种新的策略。
论文ID
原名：Delayed gut microbiota development in high-risk for asthma infants is temporarily modifiable by Lactobacillus supplementation
译名：哮喘高危患儿肠道菌群发育迟滞可通过补充乳酸杆菌暂时改善
期刊：Nature Communications
IF：12.353
发表时间：2018年
通信作者：Susan V. Lynch
通信作者单位：Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of California San Francisco, San Francisco, CA 94143, USA.
实验内容
1 介绍
遗传性过敏症，是一种对通常无害的刺激物的促炎性反应的抑制失败，是西方国家最常见的疾病之一，而且常常先于儿童哮喘的发展。独立的出生队列表明，1个月或3个月大时，婴儿肠道菌群中特定细菌属的减少与儿童发生遗传性过敏症、反复喘息或哮喘的风险增加有关。当一个月大的婴儿其肠道微生物群和粪便代谢物，表现为典型的抗炎前列腺素的前体——dihomo-γ-亚油酸酯，以及二十二碳五烯酸，抗炎ω-3多不饱和脂肪酸的明显缺乏时，其在童年发展为遗传性过敏症或哮喘的相对风险显著增加。此外，从高危新生儿粪便中提取的无菌液体可促进CD4+、IL4+扩增，降低CD4+ 、CD25+、FoxP3+细胞外频率，说明婴儿肠道菌群组成和代谢物的差异可诱发免疫功能障碍，进而导致儿童遗传性过敏症和哮喘的发生。在小鼠中，通过高纤维饮食干预(增加短链脂肪酸浓度(SCFAs)或口服乳酸菌的补充来调整肠道微生物组，可促进局部和远处的粘膜免疫，包括诱导T调节细胞群，以及由源于造血细胞的免疫细胞前体的重新分化。至少在一定程度上，这是通过微生物产生或诱导代谢产物来实现的，这些代谢产物形成了宿主免疫细胞效应物的表型。因此,越来越多的证据表面，儿童遗传性过敏症和哮喘的发生与早期肠道菌群紊乱及相关代谢功能障碍有关。
生态学的角度来看，最初的物种，即那些首先在以前原始环境中定居的物种，常常支配着生物群落条件，并影响着发展中的生态系统中物种积累的速度和随后的模式。利用这个理论框架，我们假设在出生后的第一年里，患哮喘高风险的新生儿（HR）表现出胎粪肠道菌群失调和肠道细菌多样化的降低。我们还认为，6个月大的HR婴儿每天口服补充鼠李糖乳杆菌GG(LGG)会改变高危婴儿的微生物发育，并促进诱导免疫耐受所必需的细菌分类群和代谢物。
在这项研究中，我们发现，患哮喘的高危儿童，表现出明显的胎粪微生物群，肠道微生物多样性延迟，并且在婴儿期消耗了大量的抗炎粪便脂质。在补充LGG后，这些缺陷得到了部分缓解，在6个月大时，发现补充LGG的婴儿肠道微生物的产物增加了体内调节性T细胞的数量。这种致受性效应似乎取决于持续的补充，因为这些作用在停止补充后6个月就会消失。我们的研究结果表明，早期肠道微生物体干扰和发育延缓与儿童遗传性过敏症和哮喘风险增加有关。此外，他们还表明调控新生的肠道微生物群为人类的免疫调节提供了可行的途径，并为治疗发展和未来研究提供了急需的框架。
2 结果
2.1 HR婴儿表现出延迟的肠道微生物群多样化
我们利用了婴儿益生菌补充剂（TIPS）研究的双盲、安慰剂对照试验中随机选择的婴儿亚组，旨在研究早期LGG补充剂对HR儿童过敏和哮喘发展的影响（HR；n＝25）。一组健康的无遗传性过敏症家族史、哮喘低危的婴儿，作为对照组（HC；n＝29）。在标准时间（出生、1、3、6、9和12个月）从所有参与者重复收集大便样品，进行基于16S rRNA的平行微生物群分析，并在6个月和12个月样品的子集中进行LC/MS代谢组学分析。在整个研究过程中采用调查问卷进行调查，以获取人口统计，疾病和饮食信息。
通过定量PCR和基于序列的LGG丰度来评估6个月期间对补充剂的依从性，这证实了在活动期间高危LGG补充组(HRLGG)与安慰剂组(HRP)的婴儿相比，乳杆菌的相对丰度显著更高。与HC组相比，HR婴儿接触宠物的可能性较小(Fisher精确检验；p=0.01)，更有可能是母亲或父亲有病史或活动性哮喘(临床试验纳入标准；Fisher精确检验；p=0.01)，且在12个月大时，湿疹率呈上升趋势(Fisher精确检验；p=0.07)。HC和HR受试者在出生后一年内的纯母乳喂养、配方奶喂养或混合喂养比例无显著差异(p = 0.94)。然而，在每个时间点的横断面分析显示，在12个月的时间点，HR婴儿更可能是纯母乳喂养，而不太可能是混合喂养或纯固体食物(Fisher精确检验；p=0.01)；HRP与HRLGG组之间的比较显示，在所有评估变量之间没有显著差异。
与之前的观察结果一致的是，所有参与者在出生后的第一年都表现出渐进的细菌多样性和微生物演替的证据，年龄和细菌α指数呈正相关(Faith系统发育多样性指数；线性混合效应(LME)模型；β= 4.0,p < 0.0001)和beta多样性(未加权UniFrac距离；LME模型,p < 2×10−16)。受调查的因素，年龄，独家配方喂养和母乳喂养持续时间，在出生的第一年与细菌β多样性的时间变化显著相关（LME模型；p< 0.0001,p < 0.0001, p= 0.0005，分别)。这些发现反映了之前婴儿肠道微生物群研究的观察结果。出生方式与出生后第一年细菌多样性的时间变化无显著关系，这在之前的研究中已经报道过，尽管在我们的研究中这个观察结果可能不够有力(4个剖腹产分娩婴儿)。
与HC组相比，HRP组在出生的第一年内肠道微生物多样性出现延迟（图1a；LME模型；β=0.22 vs β=0.14；β ANCOVA，p=0.02），这是由于群落丰富性和均匀性减少。相比之下，HRLGG受试者表现出与HC组相当的细菌肠道微生物多样性（图1a；LME模型，β=0.21，β ANCOVA，p=0.63）。然而，补充LGG仅挽救了菌群均匀性的缺陷；HRLGG组的细菌丰度增加仍显著低于HC参与者。这些数据表明，虽然补充LGG影响发育中的HR婴儿肠道微生物组的菌群分布，但它未能减轻细菌物种积累的缺陷，这些细菌物种的积累可能是源自婴儿的局部环境。这一观察与最近的研究表明，在房屋灰尘细菌多样性减少的住宅中长大的婴儿在儿童时期患遗传性过敏症和反复喘息的风险较高。对HC、HRP和HRLGG在每个时间点的横断面分析表明，HRLGG和HRP组在12个月大时均表现出较低的丰度(Kruskal-Wallis, p = 0.02)，与营养模式无关(线性模型；调整后的估计变化为7％)这意味着HR婴儿肠道菌群失调与年龄增长有关。与HC婴儿相比在出生后的第一年，各时间点的细菌的β多样性对比显示HRP(图1b)和HRLGG(图1c)的肠道菌群组成存在显著和持续的差异(图1c)。组间距离比较表明，在补充过程中，HRLGG婴儿的肠道菌群组成与HC受试者略相似(图1d)。这说明LGG补充影响HR婴儿肠道微生物组中相对较小的细菌分类群。
图1 哮喘高危（HR）患者的肠道微生物群成熟与健康对照（HC）有显著差异，并受口服鼠李糖乳杆菌（LGG）补充的影响。a 与HC(n=29)受试者相比，HR安慰剂补充(HRP；n=15)参与者在出生后第一年中细菌α多样化表现出显著延迟(βANCOVA，p=0.02)，这被LGG补充(HRLGG；n=10；βANCOVA，p=0.63)部分纠正。误差条表示平均值的标准偏差。b HRP(n=15)和c HRLGG(n=10)婴儿在评估的所有时间点(未加权UniFrac距离；使用PEMANOVA计算的R2和p值)的细菌β多样性方面有显著差异。d HRLGG(n=10)婴儿肠道微生物群在补充LGG期间(非加权UniFrac距离；Bon.ni校正t检验)与HC(n=29)受试者显著相似(尽管略微相似)。
2.2 胎粪微生物群在HR和HC患儿中存在明显差异。
胎粪样品中HR和HC菌群组成变化最大(图2a)；无论是否纳入或排除剖宫产的婴儿都是正确的(PERMANOVA R2=0.062, p <0.001和R2=0.060, p <0.001)。在被调查的因素中，亲代哮喘和活动性亲代疾病解释了胎粪分类学变异的最大程度，说明母亲和父亲的健康状况对早期肠道菌群发育有影响。如前文引用所述，在我们的研究中，剖腹产也部分解释了胎粪微生物组成中观察到的差异比例(R2=0.053, p-value=0.001)，但需要注意的是，在我们的研究中，只有一个剖腹产分娩的新生儿与HR聚集在一起(图2a)。与HC相比，HR组胎粪富含肠杆菌和类杆菌科，而Akkermansia、Faecalibacterium和Rothia在内的多个属则大大减少(图2b和补充数据1)，而稍大婴儿粪便中后者明显减少时，婴儿(1个月和3个月大)在儿童期后期出现遗传性过敏症、反复喘息和哮喘的风险增加。因此，HR婴儿在出生后的第一次大便中明显表现出婴儿患遗传性过敏症和哮喘风险增加的细菌减少特征。
我们假设，尽管存在肠道菌群的动态变化，胎粪中有一小群细菌在肠道菌群发育的第一年持续存在，而且这些菌群在HC和HR婴儿之间存在差异。持续存在的菌群(定义为在胎粪中检测到的菌群类别，以及在1、3、6和12个月收集的所有后续样本)的中位数很小，HC (n = 9)和HR (n = 14)组之间没有差异，尽管这些持续存在的菌群组成在两者之间是有显著差异的(图2c)。虽然特定的分类群在肠杆菌科，但链球菌、双歧杆菌和类杆菌在所有婴儿中是常见的（图2d），但在HR和HC受试者群体之间观察到了持续存在的菌群具有明显差异；HR组婴儿更可能被Blautia和Ruminococcus中的特定分类群持续定殖，而HC组婴儿在出生后第一年中肠道微生物群中保持着特定的Peptostreptococcaceae, Staphylococcus,Anaerococcus, Rhodobacter, Akkermansia,或者Faecalibacterium（图2D）。值得注意的是，在独立的横断面研究中，在HC组中观察到的这些持续存在的菌群中有几个被发现在1至3个月大的婴儿肠道微生物群中明显减少，这些婴儿的遗传性过敏症、复发性喘鸣和哮喘在儿童期风险明显增加。更确切地说，这些菌属的关键成员在pH调节、产生短链脂肪酸和影响粘蛋白的产生和代谢中发挥重要作用，这些因素对肠道微生物群落定植前景有很大的影响。因此，这些特定微生物的持续存在和活动可能代表了早期微生物发展轨迹的重要决定因素。
图2 胎粪微生物群和持续存在的菌群在哮喘高危组（HR）和健康对照（HC）组受试者存在显著差异。胎粪微生物群的主要坐标分析（PCoA）表明基于哮喘风险的显著不同的组成（HR n = 18; HC n = 17;未加权UniFrac; PERMANOVA R 2 = 0.062，p = 0.001）。b分类汇总图表明，与HC（n = 14）新生儿相比，顺产出生的HR（n = 17）胎粪中肠杆菌科和拟杆菌科的明显增多。c 持续存在的菌群在HR (n = 14)和HC (n = 9)参与者中存在差异（未加权UniFrac; PERMANOVA R 2 = 0.081，p = 0.018）。d虽然HC（n = 9）和HR（n = 14）受试者共有许多持续存在的菌群，但有几个不同（Fisher精确检验; p <0.05;黑点），包括先前被认为与儿童遗传性过敏症和哮喘发展有关。
2.3 补充LGG可增加特定粪便菌属和代谢物
通过对HC组和HRP组受试者在出生后第一年的所有的菌群丰度的评估，确定了一些值得注意的种属，包括双歧杆菌、乳酸菌、瘤胃球菌、梭状芽胞杆菌、拟杆菌和blautia，这些分类群在以年龄为基础的发育梯度上可区分各组婴儿。与HC组相比，HRP组婴儿在3个月龄时表现出Bacteroidaceae和Lachnospiraceae显著和过早的增长。如先前的研究中所描述的，这些菌属的扩增发生在HC组的后期（12个月）。到了12个月，相对较少的细菌类群在HRP组中显著增多，可能是因为我们样本量较小，以及在这个发育阶段细菌群落异质性，或者在HRP肠道微生物群中扩展的非细菌物种。
在补充期间和补充后，与HRP组相比，HRLGG组菌群与HC组其菌群种类重叠较多，尽管总体而言，这只占检测到的总分类的一小部分。为了评估这些改变是否影响肠道微生物组功能，对6个月和12个月大的成对粪便样品（HC n = 15; HRLGG n = 7; HRP n = 11）的子集进行了非靶向代谢组学分析。在6个月大时，与HRP婴儿相比，HRLGG肠道内的微生物代谢与HC婴儿的微生物代谢更相似。更具体地说，与HRP婴儿相比，HC和HRLGG婴儿的特征在于富含多种脂质雄激素类固醇（图 3），已知这种激素在慢性炎症情况下会减少，并可起到对抗炎症反应的作用。脂肪酸，其在哮喘和遗传性过敏症中可以起到抗炎作用，与HRP组比较，HC组和HRLGG组婴儿粪便样品中含量最丰富的代谢物的代表，包括亚油酸衍生的ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 PUFA），二十二碳五烯酸（DPA; 22：5n3）和二十二碳六烯酸酯（DHA; 22：6n3），以及二氢亚油酸（20：2n6）和二十碳三烯酸（ETA或蜂蜜酸；20：3n9）。虽然非靶向LC/MS方法没有优化SCFAs的定量水平，但我们注意到与HRP组婴儿相比，HC组和HRLGG组婴儿4-乙酰氨基丁酸盐含量增加，这是一种替代微生物SCFA生物合成的前体。相比之下，HRP组婴儿表现出肠道炎症，包括硫代脯氨酸明显增加，它可刺激巨噬细胞吞噬和趋化于炎性病灶，以及9，13HODE，一种亚油酸的促炎代谢物，可在氧化条件下，通过P450细胞色素活性或非酶性途径产生，与组织和DNA损伤有关，最近证实并与严重哮喘有关。HRP组婴儿也证实主要以糖酵解代谢为主，而造成大量单糖相对增多。
图3 对6个月的粪便样本进行三向比对，发现健康对照组(HC)和补充鼠李糖乳杆菌的哮喘高危人群(HRLGG)的代谢产物较哮喘安慰剂组(HRP)的受试者丰富。HC (n=15)和HRLGG (n=7)与HRP (n=11)组相比，具有许多共同的大量代谢物，包括抗炎雄激素类固醇、长链脂肪酸和多不饱和脂肪酸。相比之下，HRP患者显示糖酵解增加和脂质代谢明显产物。
对比6个月大的样本(补充期结束时)，与HRP组相比，HRLGG组婴儿12个月大的粪便代谢组不再与HC组相似(补充图6b和c)。仅有少量代谢物对这三组12月龄婴儿进行鉴别(补充图6b和7)，HRLGG组仅表现出与HC组婴儿相同的抗炎PUFA、DPA和微生物源单链脂肪酸10-壬基酸和10-肝烯酸(具有T细胞刺激能力)。我们注意到，与HRLGG组相比，HRP婴儿富含三羧酸(TCA)循环中间产物乌头酸盐，其聚集与巨噬细胞对细菌的清除不足有关。
基于我们的代谢谱数据，我们假设6个月大的HRLGG婴儿的肠道微生物群和相关的代谢产物促进了以Treg细胞增多为特征的耐受性条件。为了验证这一假设，我们使用先前描述的离体树突状细胞(DC)/T细胞测定法，以及来自每组婴儿的一组样本(n=5)过滤后的无菌粪水。与6个月龄HRP患者的粪水相比，HRLGG能显著增加Treg细胞的比例（LME模型，p=0.008，图4a），IL10浓度有升高的趋势（LME模型，p=0.078，图4b）。来自12个月大的样品的粪水在三组中的 Treg种群中没有产生显着差异（图 4c，d）。
图4鼠李糖乳杆菌(LGG)相关的粪便样品在6个月大时促进Treg细胞扩增和体外IL10的产生。从6个月大的HRLGG组(n =5)的粪便液体与HRP组(n = 5)、或HC(n = 5)组相比，诱导a. Treg细胞和b. IL10比例增加。在12个月大时，在停用LGG后6个月，三组间c. Treg细胞和d. IL10表达比例无差异。
3 讨论
独立的横断面研究已经相对一致地证明，在1或3个月大的婴儿肠道菌群中，特定细菌的缺失与随后发生遗传性过敏症、反复喘息或哮喘的风险增加有关。在这里我们证明肠道菌群失调在HR新生儿的第一次肠运动中是明显的，并且与父母疾病密切相关。我们的观察反映了一项研究，在这项研究中，孕妇血糖控制(糖尿病的一种)与胎粪细菌菌群共同变化。这些数据表明，妊娠期间父母的健康状况可能影响垂直遗传的微生物种群，这些微生物群启动肠道微生物组发育，并影响早期免疫成熟。实际上,我们提供了第一个证据表明HR婴儿在胎粪中表现出独特的创始细菌类群，在出生后第一年表现持续存在,并且在免疫成熟的关键时期，细菌物种积累的平行复合延迟，无论LGG补充或营养模式。这些数据支持了这样一种假设，即人体肠道菌群遵循生态演替的中心原则，胎粪菌群组成的差异与不同的肠道菌群发育轨迹有关。观察到在婴儿肠道菌群中，有少数特定的细菌分类群在生命的第一年持续存在，这似乎可以解释为什么早期的微生物接触与儿童疾病的发展有关。这些原始物种在新生儿和婴儿的肠道中定植，通过持续的竞争定植、资源隔离、宿主免疫调节，或通过影响在这一关键发育窗口期的生理发育，影响随后的微生物群落发育，这是可信的。
有趣的是，虽然补充LGG挽救了HRP婴儿中观察到的微生物群均匀性缺陷，但它没有减轻这些婴儿中观察到的细菌物种积累的延迟。在我们的研究中，HR婴儿暴露于宠物的可能性显著降低，众所周知，宠物会增加住宅灰尘细菌的多样性，这意味着建筑环境是婴儿微生物群发展的外源微生物物种的来源。因此，虽然补充LGG可以部分挽救肠道微生物分布的内源性差异，但似乎无法弥补暴露于环境微生物的减少，环境微生物可能扩大肠道微生物多样性和功能储备。
在补充乳酸杆菌6个月后，HRLGG组受试者其大便主要由抗炎脂肪酸代谢产物组成，现认为这些抗炎脂肪酸可促进婴儿早期的免疫耐受。这些观察结果与1月龄婴儿的独立出生队列中的观察结果一致，这些婴儿在儿童期变异性致敏和哮喘的风险显著降低。在这两种情况下，肠道微生物相关产物在体外诱导T调节细胞，这表明至少在补充过程中，LGG会将肠道微生物组的组成和代谢重新安排到能够诱导免疫耐受，这是预防遗传性过敏症和哮喘的必要条件。然而，在6个月内观察到的HRLGG婴儿的代谢特征在12个月的时候基本无法维持，并且在停止补充LGG后水平降低。LGG并不具有产生产出大量抗炎脂肪酸的能力，相反，它能够促进脂肪酸结合生物体，如双歧杆菌的增加。因此，为了维持HR受试者免疫功能持久，可能需要改进设计合理的多元微生物，包括可成功移植并编码更广泛功能的协同微生物物种，如抗炎脂肪酸生物合成和代谢的基因通路。或者，在怀孕期间引入这种微生物可促进其垂直传播和早期生命移植，为疾病预防提供替代策略，尽管需要更多的工作来测试这种干预的有效性和安全性。
我们的研究首次证明HR婴儿在出生后第一年表现出独特的胎粪细菌群落、菌群的成熟轨迹和粪便代谢组。该研究还表明，每天补充LGG会导致新生儿肠道菌群中微妙但重要的分类和代谢重构，这些重构促进体外T -调节细胞的诱导，但这些影响似乎取决于持续的补充。为新生肠道微生物群的可塑性提供证据，确定出生后早期是安全干预的关键窗口，并确定保护性新生肠道微生物群的功能特征，为旨在预防疾病的新干预提供了急需的框架。