科研 | SBB：宏转录组揭示了气候变化对欧洲草原中根际微生物组的影响
编译：小白同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
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论文ID
原名：Metatranscriptomics reveals climate change effects on the rhizosphere microbiomes in European grassland
译名：宏转录组揭示了气候变化对欧洲草原中根际微生物组的影响
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.29
时间：2019.09
通讯作者：Werner Liesack
通讯作者单位：马普学会陆地微生物研究所
实验设计
本实验平台(GiFACE)位于德国吉森附近的温带草地，由3个环境CO2浓度水平 (aCO2)和3个CO2升高(eCO2)20%(约400×1.2=480 ppm)的环形小区组成，环内径为8m (图1)。自1998年起，全年都在白天进行二氧化碳补充(从日出后2小时到日落前2小时)。植被为草本、禾本和豆科植物的混合，以虎耳草为主，每年大约在5月底和9月初进行修剪。土壤为Fluvic Gleysol，表层为砂质粘土，平均C和N含量分别为4.5%和0.45%，pH为6.0。GiFACE站点夏季平均气温18.0℃，累计降水量127.0mm。自1996年以来，该草地每年施氮量为40kg/ha。土壤温度、空气温度和降雨量由GiFACE的气象站记录。于除草前，2015年8月28日和2017年8月24日9:00-11:00，在上述6个小区各分别用3.5 cm直径取样器在内部不同区域取8-10 cm土壤4份。驱车1小时送至实验室，震落大块土后仍然粘附在根上的剩余土壤被定义为根际土壤。混有微生物群落的根系进一步用0.85% NaCl无菌盐水清洗，并涡旋60 s。将分离的根际土壤和植物根系置于试管内，立即放入液氮中冷冻，储存在−80℃冰箱留用。提取根际土壤（2015年的每小区三个平行样品，2017年的四个平行，3×6 + 4×6 = 42个样品）和植物根系（48个样品）的RNA并纯化, 进行RT-qPCR及Illumina测序。所得下机序列经合并后进行过滤，高质量序列进一步提取SSU rRNA和mRNA并分类注释。提取0.5g土壤样品的DNA并测定浓度，土壤DNA的qPCR和RNA的RT-qPCR结果用于计算细菌和真菌基因与转录的比例，并进行方差分析。用DESeq2包分析CO2含量升高对根际物种相对丰度和功能的影响，为校正不同样本测序深度的差异，对数据进行了处理，经对数转换后进行多重检验和相关分析。
图1 GiFACE 场地的航拍。自1998年5月起，E1-E3三个试验区全年白天接收的二氧化碳浓度比大气中二氧化碳浓度高出20%，A1-A3三个小区为对照。
结果
1 GiFACE实验平台气象记录
2015年夏季，中欧大部分地区在7月和8月经历了酷暑热浪，这两个月的日平均气温为20.4℃，平均土壤温度(0-10 cm)为20.0℃，累积降水量为85.4mm。2017年7-8月平均气温较低:环境温度18.8℃，土壤温度18.9℃(图2)，累计降水量为212.8mm。2015年8月6日至15日遭遇了强度高且长时间持续的热浪，平均的环境空气和土壤温度分别为23.7℃和21.5℃。CO2含量的升高对2015年和2017年7-8月根际土壤含水量无显著影响。
图2 2015年和2017年7-8月日平均气温(a)和土壤温度(0-10 cm) (b)。2017年7月底和8月初的高温伴随着强降雨，可能部分抵消了这一时期环境气温导致的地表土壤温度升高。
2 宏转录组文库
共测序了42个(根际土壤)和48个(植物根系)cDNA文库，过滤后得到1.48亿条序列 (FASTA格式约107 Gb)，平均长度为277 bp(土壤样本)和290 bp(根)。约50%的reads匹配为SSU rRNA (土壤3790万，根3750万)，在根际土壤(260万)和植物根系(120万)样品中分别约1.5%和3.9%的reads被推断为mRNA，其余大部分reads与大亚基(LSU) rRNA相关。超过160万条mRNA reads(土壤110万条，根50万条)归类为细胞物质。在50万条根的mRNA reads中，有一半来自植物源，包括茜草科(~3%)、豆科(~3%)和果树科(~89%)，剩下的一半来自根相关的微生物群体。除了来自根际微生物的mRNA，该课题组还对根系的mRNA序列进行了功能注释以了解其转录组水平上对于CO2浓度升高的响应。
3 eCO2对地下生物群体的影响
对于2015年8月的样本，eCO2对从界到科水平的根际微生物物种组成(SSUrRNA、mRNA)有显著影响，对根际微生物和植物根系的功能表达也有显著影响。而对于2017年8月的样本，eCO2对根际微生物群落组成几乎没有影响(图3和图4)，同样，对根际微生物和植物根系的功能表达也无显著影响。后续主要讨论2015年8月二氧化碳浓度升高所观察到的效应。
图3 eCO2对2015和2017年8月样本宏转录组中rRNA和mRNA丰度的影响，在界分类水平上对根际土壤微生物(a)和根相关微生物群落(b)进行了分析，以星号表示aCO2和eCO2小区之间的显著性差异，* * * p < 0.001。
图4 eCO2对2015和2017年8月样本宏转录组中rRNA和mRNA丰度的影响，跨三个界分析了的根际土壤(a)和根相关(b)微生物。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001
4 eCO2对物种组成的影响（2015年）
所有根际土壤样品中都以细菌为主，真核生物和古菌次之。而根相关微生物的SSU rRNA大部分属于真核生物，其次是细菌和古菌。在根际土壤中，eCO2条件下细菌SSU rRNA相对丰度从84.5%显著提高到94.1%，真核生物SSU rRNA相对丰度从14.8%显著降低到5.2%(图3a)。细菌丰度的增加体现在酸杆菌、放线菌、拟杆菌、绿弯菌、浮霉菌和变形菌的富集。真核生物丰度的下降主要与真菌有关，也涉及阿米巴虫、后生动物和原生藻-囊泡虫-有孔虫(SAR)生物群的显著减少(图4a)。奇古菌门是主要的古菌(约0.7%)，相对丰度未受eCO2影响。在植物根系上，eCO2条件下真核生物的SSU rRNA丰度从61.9%下降到54.2%，但变化不显著(图3b)，在真核生物中，SAR是eCO2作用下唯一显著减少的分类单元(图4b)。
下面讲一下eCO2对细菌和真核生物的作用。细菌中放线菌门和变形菌门为优势物种，各贡献了根际微生物组超过30%的比例。此外，各样品中酸杆菌, 拟杆菌, 浮霉菌, 疣微菌的相对SSU rRNA丰度都>1%。在根际土壤中，eCO2显著富集了嗜热菌和MB-A2-108(放线菌)，而疣微菌丰度显著降低。在科水平上，eCO2条件下诺卡氏菌 (放线菌)丰度显著升高，而Chthoniobacteraceae、Xiphinematobacteraceae (Spartobacteria)和慢生根瘤菌的丰度显著降低。在根际土壤中，真核生物主要有真菌、阿米巴虫、后生虫和SAR生物群。真菌是根际土壤和植物根系中最丰富的真核生物，占比分别为50%和90%以上(图5a)，子囊菌、担子菌和毛霉菌为优势菌。在eCO2条件下，真核生物中球囊菌显著增多(图5b)。eCO2对其他真菌的影响与生境有关，根际土壤中担子菌相对丰度显著降低，而根相关微生物组中子囊菌丰度显著降低。阿米巴虫是真核生物中第二多的门类，其相对丰度(占真核生物SSU rRNA总数的15.5%)未受eCO2影响(图5a)。除了真菌，线虫是唯一响应eCO2的真核生物，其SSU rRNA相对丰度在根际土壤和根相关微生物群落中均有所增加。
图5 2015年8月样本宏转录组中eCO2对真核生物(a)和真菌(b) SSU rRNA丰度的影响，分别对根际土壤微生物和根相关微生物群落进行了分析。
5 eCO2对微生物功能表达的影响（2015年）
对于mRNA功能注释，超过60万个reads(根际土壤微生物组394,179个，根相关微生物组86,376个，植物根系137,037个)可比对到KEGG数据库。aCO2和eCO2下的根际微生物在蛋白编码基因功能表达谱KEGG 2、3层级上均有显著差异。下面将eCO2效应分别按根际土壤微生物组、根相关微生物组和植物根系进行介绍：对于根际土壤微生物组，2015年在KEGG 2级上，22个类(7个增加，7个减少)中的14个类(如折叠、分拣和降解、膜转运、核苷酸代谢、转录和翻译)受到eCO2的影响(图6a)。在KEGG 3水平上，280个类别中，有58个类别(15个增加，43个减少)的mRNA丰度在aCO2和eCO2之间存在显著差异(图7a)。eCO2作用下，与核糖体、转录机制、氧化磷酸化、RNA聚合酶、翻译和转录因子相关的转录本数量显著减少(图7b)，而与转运和群体感应相关的功能基因表达量显著增加。在aCO2和eCO2样本中，真核生物主要富集了氧化磷酸化类mRNA，而与ABC转运和群体感应相关的转录本主要由细菌贡献。
图6 2015年酷暑时植物根系、根际土壤和根相关微生物mRNAs功能分析的热图 (a)，功能描述基于KEGG水平2的注释，*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001。进行了植物根系与根际土壤微生物物种丰度和根系相关种群之间的Spearman相关性分析(b)，显著的强相关性以星号表示(Spearman相关系数*|ρ| > 0.6且P < 0.01)。
图7 根据KEGG水平3的分类鉴定，aCO2和eCO2小区里根际土壤微生物(a, b)和根相关微生物群落(c, d)中mRNA丰度存在显著差异，结果展示为火山图和条形图。火山图中，mRNA丰度存在显著差异的以彩色表示，其中红色为丰度增加，蓝色为减少；柱状图展示了显著受eCO2影响的主要类别(丰度> 0.5%)。
对于根相关微生物组，eCO2条件下，KEGG 2水平上参与折叠、分拣和降解的转录本数量显著减少，而与膜转运相关的mRNA显著富集(图6a)。在KEGG 3水平216个类别中，aCO2和eCO2有16个(3个增加，13个减少) mRNA丰度有显著差异(图7c)。在eCO2条件下与膜转运、内质网蛋白加工、蛋白酶等相关的mRNA显著减少，而转运蛋白相关的mRNA则显著富集。分析显示，跨膜运输和内质网蛋白加工过程主要由真核生物主导(mRNA相对丰度88.5%-95.4%)，而转运蛋白相关mRNA主要由细菌贡献。对于植物根系，eCO2对萜类和多酮类生物合成相关的mRNA表达有显著促进作用。而在根际土壤和根相关真菌中，这与真菌mRNA丰度呈显著负相关(图6b)。在KEGG 3水平上，eCO2条件下与丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢及氮代谢相关的mRNA丰度显著降低，这主要是由于谷氨酸合成酶表达差异所致。
6 qPCR和RT-qPCR
定量PCR结果显示，2015年和2017年eCO2对细菌和真菌SSU rRNA基因拷贝数均无显著影响(图8a)。然而，2017年细菌和真菌SSU rRNA基因拷贝数均显著高于2015年(方差分析，p < 0.05)。RT-qPCR显示2015年8月，eCO2作用下真菌SSU rRNA拷贝数下降约60% (p <0.001)(图8b)。相应地，真菌/细菌SSU rRNA转录率从0.0093 (aCO2)显著降低到0.0032 (eCO2)(p < 0.001)。2017年eCO2对SSU rRNA转录数没有显著影响，细菌和真菌的转录数均显著高于2015年(p < 0.05)。2017年aCO2和eCO2的真菌/细菌SSU rRNA转录率无显著差异。
图8 采用qPCR (a)和RT-qPCR (b)分别测定了根际土壤细菌和真菌SSU rRNA基因和转录本拷贝数。通过单因素方差分析和Tukey检验确定 (P < 0.05)组间差异的显著性并用不同字母表示。
结果
1 eCO2对GiFACE实验场地根际微生物群落的总体影响
利用宏转录组“双RNA方法”比基于DNA的研究在识别微生物种群响应eCO2方面更加敏锐。然而，没有发现2017年eCO2对根际微生物群落结构(rRNA)和功能活性(mRNA)有显著影响。这也证实了2010年9月和2012年7月GiFACE样本在DNA水平上的研究的结果：GiFACE场地中二氧化碳的适度升高不会加速植物碳转移活动（如根沉积物和根系分泌物进入根际土壤）。事实上，研究表明要使土壤微生物群落改变，通常需要比该实验更高的CO2浓度(≥550 ppm)。原位13C标记实验表明，更高的二氧化碳含量增加了植物初级生产量，进而增加了根际碳输入，表现为一些细菌和真菌磷脂脂肪酸中植物源13C显著升高。因此可以推断，适度升高CO2对正常夏季GiFACE场地中根际微生物群落的组成、结构和功能活性没有显著影响。
与气温接近长期平均水平的2017年夏季相反，2015年的酷暑为研究极端气候下eCO2效应带来新的机会。出乎意料的是，2015年8月eCO2对根际微生物群落的影响在界水平上最为明显(图3)。根际土壤中细菌的SSU rRNA和mRNA丰度显著增加，真核生物反之；RT-qPCR也进一步证实了eCO2作用下根际土壤真菌rRNA的减少，但qPCR结果未发现其对真菌SSU rRNA有显著影响。或许eCO2对真菌活性有抑制作用，但对其总生物量并无影响。值得注意的是，根际土壤中真核生物SSU rRNA相对丰度的显著降低不仅与真菌有关，还涉及阿米巴虫、SAR生物群和后生动物的减少。同时细菌SSU rRNA丰度的显著增加主要体现在放线菌上，也涉及其他门类。eCO2和升温的结合对根际土壤中真菌等真核生物有不利影响，eCO2条件下氧化磷酸化相关mRNA的减少也进一步证实了这一结论。
相似地，在澳大利亚草原进行的多因素FACE实验也表明，eCO2 (500ppm)和升温(相对环境温度升高2℃)的结合对真菌丰度和多样性产生了不利影响。近期美国“草原气温和二氧化碳含量升高”实验平台一项基于GeoChip的研究显示，与“仅升温”相比，eCO2 (600ppm)结合升温(日+1.5℃，夜+3.0℃)显著改变了半干旱草原中微生物群落的结构和功能。GeoChip 3.0分析结果显示，参与碳降解、碳固定和甲烷代谢的基因丰度发生改变。在分类学水平上，放线菌和变形菌被明显富集。这些研究都表明eCO2结合升温对地下生物群落有重要影响，而这些影响将取决于多种因素，例如植被覆盖、土壤理化特性和气候等。下面分别讨论一下eCO2对根际土壤微生物组、根相关微生物组和植物根系的rRNA和mRNA的影响。尽管mRNA reads数量少，但有证据表明在KEGG2、3水平上，aCO2和eCO2条件下功能基因表达量存在显著差异。
2 eCO2对根际微生物的影响
在根际土壤中，eCO2造成的rRNA丰度变化主要与真菌减少和放线菌增加(尤其是嗜热菌)有关(图4)。在真菌中, 伞菌纲、银耳纲等丰度减少, 但球囊菌纲的丰度增加(图5)。放线菌因其耐热性和抗旱性在2015年8月的样本中被富集，此外，其较强的生存能力或与有机物分解能力有关。分析功能表达情况发现，与氧化磷酸化相关的真核mRNA丰度在eCO2条件下显著降低。氧化磷酸化是真核生物产生三磷酸腺苷(ATP)最重要的代谢途径，这表明eCO2对真核生物活性有负面影响，相关机制有待进一步研究。而根相关细菌中，变形菌和放线菌门最多；2015年8月eCO2作用下，植物根系上转运蛋白相关mRNA显著富集且主要由细菌表达(图7b)。转运蛋白用于跨膜运输，在解毒和应对生物/非生物胁迫方面也发挥重要作用，这或许是eCO2条件下细菌较真核生物更有竞争优势的重要原因。真菌中，根上锤舌菌的丰度明显高于根际土壤；值得注意的是，在eCO2条件下，它们在植物根系上的丰度显著降低，而在根际土壤中则没有(图5b)，这类真菌中有许多为内生菌或植物病原体。锤舌菌纲SSU rRNA减少(图5)的同时，eCO2条件下膜运输和内质网中蛋白加工相关的真核生物mRNA也显著减少。真核生物膜运输系统促进了细胞内细胞器之间的蛋白质和脂质的运输，这对于植物和真菌病原体的相互作用至关重要。内质网中蛋白加工相关的转录本与热休克蛋白(HSP)家族有关，HSP家族在真菌形态变化及应激反应中有重要作用。由此推测，在eCO2作用下，根相关真菌膜运输和HSP活性的降低削弱了其感染宿主植物和防御植物次生代谢物的能力。在根际土壤中相对其他真菌，球囊菌(丛枝菌根真菌，AMF)在eCO2作用下显著富集(图5)，这可能是植物为根际分配了更多光合产物的结果。较之其他真菌，AMF中蛋白折叠和降解等代谢活动可能有所增加。
3 eCO2对根系转录组的影响
通过对植物根系mRNA的功能注释或可解释为何2015年酷暑时CO2浓度升高会对根际微生物群落产生影响。分析aCO2和eCO2样本发现，在KEGG2、3水平上，eCO2导致植物根系mRNA发生一系列变化。2015年8月eCO2作用下，植物次生代谢产物显著增加，而氮代谢显著降低。萜类合成相关的根系mRNA丰度增加了58%以上；而涉及苯丙类合成的根系mRNA丰度增加了约15%。缺氮可导致植物次生代谢发生重大变化，并导致苯丙烷代谢产物的增多。另有研究表明，相对于仅升高温度的处理，eCO2 (700ppm)结合升温(分别为+2℃和+5℃)条件下，某些植物次生代谢产物显著增多。植物次生代谢物常用作应对昆虫和病原微生物的防御机制，所以2015年eCO2条件下植物次生代谢产物的增加或为其防御策略。
结果
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