科研 | Frontiers in Microbiology：耐盐盐生植物的根际细菌可促进苜蓿在高盐环境下的生长
编译：白云，编辑：十九、江舜尧。
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美国西南部以及世界上很多地区的农业领域都严重依赖水源灌溉。在许多类似的地区，由于干旱和灌溉不良导致土壤中的盐分持续增加。据统计，全球约15％的耕地是需要灌溉的，而这些灌溉区域却提供了粮食总产量的40%。在美国，土壤盐度以及水分含量影响了大约国内30%的灌溉耕地，而全世界也有50%的灌溉耕地也受到盐度和水分含量的影响。灌溉区域土壤盐度的上升主要是由于灌溉水中含有可溶性盐分，且盐分经蒸发和蒸腾作用后全部留在了土壤中。盐生植物是天然的耐盐害植物，它们已经进化为可正常生长在盐渍化土壤中的植物，但不同种类盐生植物的耐盐害能力也是不同的。美国犹他州的大多数地区都是高盐沙漠，这里有多种多样的天然盐生植物。很多研究证明根际细菌或植物内生菌可显著促进植物适应各种逆境。所以，从高盐环境中来筛选鉴定土壤细菌，从而来寻找有益微生物，将这些有益微生物接种于非寄主植物，最终促进非寄主植物在高盐环境下的生长。目前，美国沙漠地区天然盐生植物与微生物组之间的关系研究较少。大盐湖和一些海洋环境中的嗜盐微生物已经有过相应的研究，但是水环境中的微生物与荒漠土是完全不同的。我们主要针对生在犹他州湖南部高盐地区的三种盐生植物，该地区土壤盐分含量在16-100 dS/m之间（当地苜蓿生长地区月0.7-1.6 dS/m；海水约55 dS/m）。
论文ID
原名：Salt-Tolerant Halophyte Rhizosphere Bacteria Stimulate Growth of Alfalfa in Salty Soil
译名：耐盐盐生植物的根际细菌可促进苜蓿在高盐环境下的生长
期刊：Frontiers in Microbiology
IF：4.259
发表时间：2019年7月
通信作者：Brent L. Nielsen
通信作者单位：美国布里格姆杨大学微生物与分析生物学系
实验设计
本研究首先在美国犹他州中部的沙漠地区进行采样，采样时围绕该采样点三种天然盐生植物（Salicornia rubra, Sarcocornia utahensis, Allenrolfea occidentalis）进行，分别取根际土壤和植物根系，取样时间为期两年，共取6次样品，取样时采集没有生长植物处土壤作为对照处理。将根际土壤置于PBS（磷酸盐缓冲液）中涡旋混匀，之后将样品涂抹在含有1M NaCl的LB培养基上。为了分离内生菌，将根系样品进行表面灭菌后加入PBS缓冲液进行研磨。为了确定分离菌株对盐害的最大耐受性，使用含有不同浓度NaCl的LB培养基，将分离菌在培养基上重新划线，并测定每个分离菌的菌落形态、色素沉着、生长温度范围。通过16S rRNA测序鉴定分离菌株的种类（测序引物：8F; 1492R），同时也测定土壤根际样品不可培养菌的种类（测序引物：515F; 806R）。利用95孔板测定分离菌株形成生物膜的能力。将分离得到的菌株作为接种物，评估其对苜蓿幼苗生长的促进作用。为了确保试验中存在的唯一细菌是接种菌，供试土壤经高压蒸汽灭菌，种子也经过严格灭菌处理。试验结束后收集土壤和根系样本，将土壤在无菌PBS中稀释，并涂布在含有1M NaCl的LB琼脂平板上。将根进行表面灭菌，在无菌PBS中研磨后进行涂平板。最后再次进行测序，并比较菌落形态以确认试验结束后的细菌与接种菌是否相同。经过室内控制实验后，再进行温室培养试验进一步确定在高盐环境下分离菌株是否对苜蓿幼苗生长存在促进作用。
结果
1 根际细菌和植物内生菌回收和表征
样品采集点主要包括高度盐渍化的土壤和三种盐生植物（图1）。植物周围的土壤盐分在春季为16-18 dS/m，在秋季高达70 dS/m（表1），这可能是由于降雨主要发生在冬季和早春，紧接着是高度干燥的夏季。在没有植物生长的区域盐度高达45-100 dS/m，盐度的变化主要取决于季节的变化。所有土壤样品的pH皆在7.56-7.98之间（表1）。
在含有1M NaCl的LB培养基上回收分离菌。试验发现不同的分离菌的盐度耐受能力不同，有的分离菌甚至可以在4M NaCl的条件下生存（表2）。
2 DNA序列分析和细菌种类鉴定
来自41个独立分离菌的16S rRNA扩增子序列进行BLAST分析以鉴定细菌种类。经过鉴定后发现许多分离菌属于同一菌属，但是根据菌落形态和革兰氏染色无法进一步在物种水平进行分类。最常见的菌属是Halomonas，Bacillus和Virgibacillus。
为了获得每种盐生植物细菌多样性的更详细信息，作者通过Illumina测序分析总根际DNA。16SrRNA测序鉴定到一些与平板分离菌相似的OTUs，如两种方法均鉴定出Halomonas, Kuchneria, Bacillus等细菌。另外，细菌群落对春季到秋季的季节性波动非常敏感（图2），这可能由于土壤盐度的显著变化，从春季的16-18 dS/m表位秋季的70 dS/m。通过分析根际独有OTUs可以发现，Allenrolfea occodentalis比其余两种盐生植物更独特（图3）。
3 分离菌株生物膜的形成分析
在LB + 0.25 M NaCl中生长时，Halomonas，Kushneria和Zhihengliella分离菌形成了生物膜，而其他分离菌不形成或不能形成可检测的生物膜。一些研究证明一些细菌菌株生物膜的形成与植物根系对土壤的粘附有关。
4 筛选对苜蓿生长有促进作用的菌株
研究表明盐单胞菌（MK873884）和芽孢杆菌（MK873882）接种至苜蓿后可显著刺激其生长（图4,5）。接种盐单胞菌的苜蓿总生物量比未接种的苜蓿高2.4倍（图5）。
5 从接种植物的土壤和根中回收接种菌
为了确定细菌接种物是否能够在土壤中定殖或成为苜蓿根的内生菌，等试验结束后收获苜蓿和土壤进行细菌的鉴定。菌落显示与接种植物的细菌具有相同的特征，并且也通过测序确认了其细菌种类[Halomonas（MK873884）和芽孢杆菌（MK873882）]。接种后的苜蓿根内也产生了与接种菌相同的细菌，而对照处理和接种其他细菌的植物根中为检测到细菌。我们注意到盐单胞菌和芽孢杆菌能够与苜蓿形成内生关系，最终刺激其生长，这证明它们可作为接种菌用于增强非宿主植物在盐渍土壤上的生长。
6 温室研究中的生长刺激
由于上文中的刺激试验是在封闭的、可控的环境下进行的。所以作者进一步在温室中进行了培养试验。与早期研究一样，用于灌溉的水中含1% NaCl，同时将分离菌（盐单胞菌和芽孢杆菌）进行接种。在灌溉水中没有盐的情况下，接种嗜盐细菌处理和对照之间，地上部或地下部生物量不存在差异。但在高盐环境中，接种盐单胞菌和芽孢杆菌后促进了苜蓿的根系生长（图6），与对照相比，根系长度在接种盐单胞菌后增加了2.6倍，在接种芽孢杆菌后增加了1.5倍。接种芽孢杆菌后地上部长度也显著增加。此外，接种芽孢杆菌（Su1-1）在根和茎生物量方面表现出比接种盐生单胞菌（A07-1）更好的结果，与对照处理相比，根鲜重至少增加4.5倍，茎鲜重增加21%。接种芽孢杆菌（Su1-1）后苜蓿总鲜重显著增加。除此之外，无论是接种盐单胞菌处理和对照处理中都有两株苜蓿死亡，但接种芽孢杆菌却没有苜蓿死亡。
讨论
为世界人口生产足够的粮食是一项严峻的挑战。许多地区由于城市化的发展导致农业土地流失以及土地退化，水质下降和土壤盐渍化等问题都加剧了这一挑战。这些因素导致全世界很多地方只能使用贫瘠的土壤、较差的水质去生产工人们消费和动物食用的农产品。让植物慢慢进化成为可适应不断变化的环境胁迫的物种，从而达到可持续发展的水平，这是十分迫切的。
本文针对犹他州中部地区的三种盐生植物的细菌群落进行广泛的调查。本研究共分离、鉴定出41个细菌，包括很多属于同一个属的可培养嗜盐菌。这些通过分离培养得到的菌株在形成生物膜的能力，盐分的最大耐受度以及色素沉着和菌落形态方面都各不相同。由于类胡萝卜素的存在，一些分离菌株具有较强的黄色，橙色或红色色素沉着，这可能有助于保护细菌免受紫外线辐射的伤害。盐单胞菌种（基于测序和形态特征来分析极有可能是H.elongata或H.huangheensis）被发现是根系内生菌，而且同时出现在三种盐生植物中。对土壤或根组织进行测序分析鉴定出许多不可培养的细菌，包括普通土壤常见的细菌门类成员和一些存在于极端环境（如沙漠和盐水条件下）的细菌。Allenrolfea occidentalis的根际存在最多的独有OTUs，而Sarcocornia utahensis拥有最少的独有OTUs。34%的根际OTUs是这三种盐生植物共有的部分。
本研究最主要的优点是筛选出两个可促进苜蓿幼苗在盐渍土壤上生长的菌株。在存在1%NaCl的情况下，将这两种菌株（盐单胞菌、芽孢杆菌）接种于苜蓿幼苗都可促进苜蓿生长，但芽孢杆菌对茎和根的生物量具有更强的促进作用。从接种后的苜蓿根部回收细菌并鉴定，结果表明这两种菌株可以成功接种于苜蓿以促进其在盐渍土上生长。
研究还表明在高盐环境下其他几种分离菌株对苜蓿的生长没有促进作用。我们还测定了以前报道过的芽孢杆菌GB03菌株，它被认为在高盐环境下可刺激植物生长的，但在本研究中未观察到盐渍土中苜蓿的生长受到显著促进。这也就表明GB03在高盐环境下仅会促进部分植物物种的生长。在高盐环境下，每一种菌株和植物间通过相互作用来促进植物生长的过程可能涉及到不同的机制，也就是说某一个菌株在高盐环境下可能促进这种植物的生长但对另一种植物却没有类似的促进作用。如在人参中，Paenibacillus yonginensis菌株DCY84T通过诱导防御相关系统（包括离子转运，ROS酶产生，脯氨酸含量，总糖和ABA生物合成相关基因）来保护免受盐胁迫。也研究组织发现，Bacilllus amyloliquefaciens的内生菌株通过产生ABA以响应增加的盐度，提高谷氨酸和脯氨酸的含量以增加水稻的抗盐性。除了以上的例子之外，还有很多文章指出不同的菌株可促进各种植物的生长，这都表明此类“促进效应”植物宿主和细菌物种具有特异性有关。
嗜盐细菌促进植物生长的机制包括细菌对盐离子的结合、产生挥发性化合物、刺激基因表达等其他信号，最终通过提高光合作用或寄主植物的其他变化来促进生长。还有一些微生物会在根际产生生物膜来捕获水和养分，减少植物对土壤中钠离子的吸收。在非盐害条件下，内生菌促进植物生长可能是通过获取营养物质和影响基因的表达等方式来实现。植物内生菌Burkholderia phytofirmana PsJN在八个柳枝稷品种中，可促进其中六个品种的生长。研究发现接种该菌株后会诱导植物宿主中基因表达的广泛变化，其中包括调节某些植物胁迫因子基因表达的转录因子。本研究中将嗜盐菌接种于苜蓿幼苗的作用机制可能也是诱导了植物基因表达发生了变化。
评论
目前国内外在探索盐生植物耐盐性的生理和分子机制取得了相当大的进展。然而，关于这些盐生植物受土壤，植物表面或植物组织内相关的微生物的具体影响还知之甚少。本研究从此处作为切入点，通过分离筛选天然盐生植物的根际细菌和根系内生菌，最终获得了可接种于其他非寄主植物的两个菌株。该研究思路明确，每个步骤环环相扣，尤其是在“室内控制培养试验”部分，作者不仅证明接种分离菌株可以促进苜蓿幼苗的生长，又通过测定培养后的土壤和苜蓿样品结果与之前的结果进行对比，更成分的证明了苜蓿幼苗生长的促进是由于分离菌株的接种造成的。除了研究思路外，本文的研究结果也为盐碱地上作物的种植提供了可靠的数据支撑。
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