科研 | LDD：温室中人工向土壤通气提高土壤细菌多样性和番茄根系活力(国人作品)
编译：李元，编辑：小菌菌、江舜尧。
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作物根区氧胁迫被认为是限制植物生长和产量的主要环境因素之一。良好的土壤气-液-固相比对植物生长至关重要。通常认为土壤质地和水分胁迫是限制作物生产力的两个主要因素。灌溉为农作物提供水分，通常迫使空气从土壤中排出，导致水涝发生。从土壤气体角度考虑，可以说灌溉抑制了植物的生长。前人研究已经证实，植物组织中的低氧胁迫会触发气孔关闭，由于三磷酸腺苷供应不足而导致能量不足。此外，缺氧也会影响植物根系的发育，从而降低根系吸收水分和无机养分的能力。从历史上看，最有效和最常见的方法是耕作。近年来，为解决这一问题，出现了各种土壤加气技术，如通过与空气压缩机相连的干管将空气注入地下滴灌管道、通过添加过氧化氢和将空气吸入地下滴灌。现已证明这类技术可提高棉花、小麦、菠萝、南瓜、马铃薯、西葫芦、大豆、鹰嘴豆和南瓜的作物产量。
本课题组之前的研究表明，土壤通气有利于番茄和甜瓜的生长。好氧和厌氧微生物在土壤中广泛分布，氧环境的变化必然影响土壤细菌群落的多样性、组成和结构。此外，植物的根部需要氧气进行呼吸。众所周知，大多数的土壤酶由土壤微生物分泌，尽管植物根系和土壤动物也向土壤分泌一些酶。一般来说，某些土壤酶活性的变化会改变土壤碳、氮、磷和硫循环和植物生长所涉及的土壤物质周转速度，以及土壤微生物的变化，土壤酶和土壤物质周转将不可避免地导致植物表现的变化。
因此，我们推断土壤通气可能改变土壤微生物群落结构，间接影响植物根系形态、生长和果实产量。不同的通气量和通气深度可能改变根际土壤微生物组成、结构和多样性。这些变化最终会影响植物根系的形态和活性。然而，到目前为止，还没有专门研究粘质壤土中番茄植株和土壤细菌对土壤通气量和位置/深度的响应。
本研究采用高通量测序法，评估了土壤中两个地下滴灌带深度下的四种土壤通气对温室番茄根系形态、土壤微生物组成、根区结构和多样性的影响，并进一步分析了土壤细菌群落结构和番茄根系形态之间的关系，从而为支持上述假设提供了证据。
论文ID
原名：Artificial soil aeration increases soil bacterial diversity and tomato root performance under greenhouse conditions
译名：温室中人工向土壤通气提高土壤细菌多样性和番茄根系活力
期刊：Land Degradation &Development
IF：4.340
发表时间：2019.01
第一作者：李元
通信作者：牛文全
通信作者单位：西北农林科技大学水土保持研究所
实验设计
1.1试验地点及供试土壤
试验在陕西省杨凌区大寨村 (北纬34°17’，东经108°20’，海拔520米) 的塑料温室内进行(图1)。试验地位于黄土高原南缘的关中平原，是我国西北地区的粮食主产区。研究地点位于暖温带、半湿润、季风区。年平均气温16.3℃，年平均降雨量535.6 mm，年平均日照时数2163h，年平均无霜期210d。
图1.试验场地及温室横剖图
研究使用的土壤为塿土。土壤容重为1.34g/cm3，田间持水量为28.17%，pH为7.82，有机质含量为9.4g/kg，全氮含量为1.3g/kg，全磷含量为1.4g/kg，砾石含量为25.4%(2~0.02 mm)，粉粒含量为44.1%(0.02~0.002 mm)，粘粒含量为30.5%(<0.002 mm)，孔隙度为49.38%。
温室东西方向长108米，南北方向宽8米。温室没有温度控制系统。为了在冬季夜间保持室内温度，在塑性塑料薄膜的表面铺设草席；白天，室内1向东被分割。每块地块长5.5m，宽1.5m，高垄栽培，小区总种植面积8.25m2。垄宽0.6米，沟宽0.3米，高度0.2米，作物行南北排列(图2)。
图2 小区横剖图
1.2 试验设计
本试验于2014年10月至2015年5月进行，番茄品种“粉玉阳岗”，温室前茬为甜瓜。每个种植区铺设2根地下滴灌管，管径16 mm，滴灌管间距0.5m (图2)。每小区种植番茄32株，双行种植，株距0.35m，行距0.5m，试验田两端设置保护行。土壤所加气体为空气，主滴灌管道连接到空气泵上，水和空气通过地下滴灌管道供应给土壤(图S1)。将20龄的幼苗移栽到床上，并用薄膜覆盖。
图S1 小区布设
本试验的目的是研究在土壤中两种深度放置滴管的情况下，四种不同土壤通气水平下温室番茄植株的土壤细菌群落和根系形态。试验使用两个水平滴灌管埋深(D)，D15和D40，分别表示滴灌管埋深为15和40厘米(图2)。用空气压缩机通过将空气注入小区(图S1)。有4个曝气量水平(A)：CK、A1、A2和A4，分表表示不曝气、标准曝气量的0.5、1和1.5倍。每小区气体流速为10.2L/min，曝气频率为2d一次。标准曝气量的计算公式为Va=[SL(1−ρb/ρs)]/1000，其中Va是注气量(升)，S是行与行之间30 cm；L是地块长度(550 cm)，ρb是土壤的干容重(1.34g/cm3)，ρs表示土壤密度(2.65g/cm3)，据此计算的标准通气量为407.83 L/小区。滴灌管埋深加曝气量(2×4)共8个处理(表1)，每个处理重复3次。
1.3 指标测定方法
在番茄果实首次采收的盛果期(移栽后150天)，对土壤细菌和根系形态进行了测定。每块地随机选择3株番茄植株进行标记。收集了各种样本，如下所示。
样品获取
（1）根际土壤：收获果实后，去除每株植株的地上部分，通过在植株周围挖一条立方槽，分离出一块直径0.6m，深0.7m的长方体土壤(图3)。用铲子把长方体里的植物根挖出来，把大片土壤抖掉，再用柔软的刷毛刷子把与根部紧密相连的土壤刷掉。
指标测定
结果
1 番茄根区土壤细菌群落多样性对土壤加气及地下滴灌带埋深的响应
如表2所示， D15CK、D15V1、D15V2、D15V3、D40CK、D40V1、D40V2和D40V3分别产生了大约59739、73646、59897、63732、64014、46433、62020和47224个高质量reads。通过Illumina MiSeq DNA测序，从24个土壤样本中总共获得了1430115个读数和285080个OTU(表2；图S2)。分析发现，土壤通气性对根际细菌ACE、Chao指数、Shannon和Simpson多样性有显著影响。D15CK的ACE、Chao指数和Shannon多样性均低于曝气和滴头深度为15 cm的处理(表2)。此外，D40V2的ACE和Chao指数显著高于D40CK，但细菌覆盖率指数差异不显著。在97%的序列相似性将reads聚类成OTU。8个处理的稀释性曲线随着reads数量增加而趋于平缓（图 S2a）。CK处理的OTU数目显著低于加气处理（图 S2b）。图 S3展示出细菌群落的物种均匀度在8个处理间相似，但是非加气处理下的细菌群落相较于加气处理的细菌丰富度低。
图S2（A）加气、埋深处理组合及（B）4个加气处理稀释曲线分布
图S3 加气及埋深下丰富度分布曲线
2 番茄根区土壤细菌群落的组成和结构对土壤加气及地下滴灌带埋深的响应
如图4所示，在门(A)、纲(B)、目(C)和科(D)分类水平上分析了8个处理中番茄根区土壤细菌的相对丰度。在八个处理中，变形菌、放线菌、氯杆菌、酸杆菌和拟杆菌在门水平上占群落丰度的80%以上(图4a)。在相同水平的埋管深度下，随着曝气量的增加，V1、V2和V3细菌群落中变形菌的相对丰度呈现增加的趋势。尽管如此，三种通气处理的变形菌多度均低于CK处理。与曝气处理相比，不曝气处理的酸杆菌群落丰度较低。地下滴灌管放置深度为40 cm时，A1、A2和A3处理下酸杆菌呈显著降低趋势(分别为16.28%、12.80%和7.35%)。分析发现，所有曝气处理都比CK处理(6.09%)有更高的丰度。在地下管道放置深度为15 cm时，酸性细菌占植物门水平群落丰富度的9.13%-9.85%，曝气处理的物种丰富度高于CK处理。结果表明，在埋管深度为15 cm时，酸杆菌占群落丰富度的9.13%-9.85%，曝气处理的物种丰富度高于CK处理。
图4 不同地下滴灌带埋深及加气处理下土壤细菌在门(A)，纲(B)，目(C)，科(D)分类水平群落结构
根际土壤中发现的主要细菌类是放线菌、α变形菌、γ变形菌、酸杆菌、双歧杆菌、β变形菌和厌氧杆菌(图4b)。我们的研究发现，在地下滴灌管埋深为15 cm和40 cm时，不曝气处理的γ变形菌和β变形菌的相对丰度均高于曝气处理。土壤通气导致15和40 cm地下管道放置深度的黄单胞菌数量减少。在埋管深度40 cm处，链霉菌随着曝气量的增加而减少，在A1、A2和A3中分别占细菌总数的4.68%、5.52%和5.58%。而在40 cm埋深处，随着曝气量的增加，酸杆菌和根瘤菌的数量也随之增加，而在40 cm处，随着曝气量的增加。
我们通过构建维恩图来分析不同曝气处理和地下管道放置深度处理之间的独有和共有菌群(图5)。总体来看，各曝气处理和埋管深度处理的共有科分别占土壤总科数的88.4%和97.9%，说明各处理土壤中均能存在部分细菌种类。CK处理和V2处理分别有3个独特的家系(Geobacteraceae, Hal-anaerobiaceae,Piscirickettsiaceae)和2个独特的家系(f__norank_o__34P16，f__norank_o__E6aD10)。
图5 (A)不同土壤通气条件和(B)地下管道放置深度条件采集的土壤样本中检测到的独有和共有菌群
图S4 OUTs水平下不同加气及埋深处理Venn图
在科和种水平上，根据相对丰度分析了每个处理中最丰富的50个细菌种类(图6和图5)。等级热图分析表明，V1、V2和V3的细菌群落组成在科和种水平上都与CK处理有显著不同，说明V1、V2和V3的细菌群落组成在科水平和种水平上都与CK处理有显著差异。细菌群落组成D15V3与D40V2相似，D15V2与D40V3相似，D15CK与D40CK在科水平上相似。细菌群落组成D40V1与D40V2相似，D15V1与D15V3相似，D15CK与D40CK在种水平上相似。图7描绘了不同土壤曝气处理下(A)科、(B)属和(C)种分类水平的前15的细菌显著差异(p≤0.05)。图7a的结果表明，在科水平上，微杆菌科的比例随着通气量的增加而增加，在V1、V2和V3中分别占细菌比例的1.03%、1.24%和1.54%。但各曝气处理的微杆菌科比例均低于CK处理。CK处理中Norank_c_Nitrospira、Bacillaceae、Solibacaceae_subgroup_3、Norank_o_subgroup_7、ABS-19、Rhodospirillales_Incertae_Sedis、Verrucommicrobiaceae和Norank_p_Armatmonadetes的比例显著低于曝气处理。如图7b所示，Norank_f_Cytophagaceae随着曝气量的增加而增加，在V1、V2和V3中分别占细菌总数的1.62%、1.66%和2.30%，均低于CK处理(2.45%)。Nitrospira随着曝气量的增加而减少，在V1、V2和V3处理中分别占细菌总数的1.41%、1.23%和1.03%，均高于CK处理(0.70%)。在所有曝气处理中，Norank_o_subgroup_7和Norank_f_ABS-19的比例均高于CK处理。结果表明，在科水平上(图8a)，D40处理的Opitutaceae、Oxalobacteraceae和Prevoteaceae的比例显著高于D15处理。在属水平上，D40处理的杆菌科、Norank_c_Candidatus_Jorgensen细菌和Norank_o_1013-28-CG33的比例均显著低于D15处理(图8b)。在属水平上，D40处理的Bacteriovoracaceae、Norank_c_Candidatus_Jorgensen细菌和Norank_o_1013-28-CG33的比例显著低于D15处理(图8b)。此外，D40处理的Opitutus、Leptolyngbya、Roseateles、unclassified_f__FamilyI_o__SubsectionIII、Prevotea_9的比例显著高于D15处理。在物种水平上的前15个显著差异(p≤.05)。
图6 基于属水平的土壤曝气和地下管道铺设深度处理下前50丰富度科水平细菌分布
图7 不同土壤曝气处理下细菌科(a)、属(b)、种(c)的分类水平
图8 在滴灌管埋深为15 cm和40 cm条件下，科(A)、属(B)和种(C)分类水平的前15个具有显著差异的物种(p≤0.05)
3 番茄根系形态及活性对土壤加气及地下滴灌带埋深的响应
表3表明，通气量和滴灌管埋深度对根的长度、表面积、根尖和活性都有显著影响，而对根体积没有显著影响。图6分析了土壤曝气和地下管道铺设深度处理中，丰度前50的细菌分布情况。我们对加气的调查发现，不加气处理的根系形态和活性最低。D40V3的根长、根表面积、根尖数和根系活力均显著高于D15CK和D40CK。一般情况下，曝气效益随曝气次数的增加而增加。与15 cm的地下管道放置深度相比，40 cm的深度对根系形态和活力有更大的益处。
4 土壤细菌群落的主成分分析和冗余度分析
图9 不同土壤曝气和埋管深度处理下不同土壤微生物群落的主成分分析(PCA)。注：具有相同颜色和形状的点表示每个处理的重复样品。曝气量分别为不曝气量(CK)和标准曝气量的0.5倍(V1)、1倍(V2)和1.5倍(V3)，埋管深度(D)分别为15 cm和40 cm
讨论
现有研究已经分析了土壤通气对植物和土壤的好处，包括作物产量、灌溉水利用效率、根系形态、果实营养和土壤酶活性。然而，很少有研究涉及土壤曝气过程中土壤微生物群落的组成、结构和多样性效应。本研究表明，土壤曝气改善了低氧条件，有利于土壤细菌群落和根系形态的改善。
1 根际土壤细菌与根系形态对土壤通气的响应
虽然没有报告具体研究土壤细菌群落对土壤通气的反应，但这项研究的结果与之前的一项研究相似，表明土壤细菌随着通气量的增加而增加。在本研究中，高通量测序技术加强了先前结果的可靠性。事实上，我们的结果显示，通气土壤中细菌群落的ACE、Chao指数和Shannon多样性都高于非通气土壤(表2)，这些结果表明，土壤通气影响了土壤细菌的丰度和多样性。细菌群落组成的变化主要取决于土壤微生物多样性的变化，细菌群落组成驱动的土壤养分循环的增强通常与高水平的微生物多样性有关。变形菌、放线菌、氯杆菌和酸杆菌是研究区内最具优势的门。
据报道，在关中平原林地和农田的细菌群落中，变形菌是占优势的，但它们的相对丰度值不同。变形菌表现出复杂的生活方式，可以利用各种类型的有机物。Fierer (2007)预测，共营养细菌(如变形菌)喜欢营养丰富的条件，特别是净碳矿化率高的条件，但寡营养细菌(如酸性细菌)在低碳有效性的土壤中占主导地位。有趣的是，我们的结果显示，在CK处理中，在地下管道放置深度为15 cm和40 cm时，变形菌(尤其是β变形菌)的相对丰度较高。此外，在所有曝气处理中观察到的相对丰度都较低(图4)。由于土壤细菌测定是在果实采收后进行的，整个生育期土壤通气性造成的高氧环境长期加速了养分循环。在良好的土壤-空气环境中容易分解的养分被植物利用或通过灌溉淋溶。因此，土壤通气处理降低了果实采收后土壤中β-变形菌的丰度。此外，Šibanc等人的研究表明，在高二氧化碳暴露的土壤中变形菌的数量明显多于其他土壤，这一结果与我们的结果一致，即土壤曝气后变形菌的水平显著下降。
在纲水平上，优势细菌为放线菌、α变形菌、γ变形菌和酸性细菌。土壤曝气提高了酸杆菌的丰度，降低了γ变形菌的丰度(图4b)。γ变形菌含有多种植物病原菌，如柑橘溃疡病菌(Xanthomonas Axonopodis pv. citri)、紫丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)和叶缘焦枯病菌(Xylella Fastidiosa)。此外，γ变形菌相对丰度的增加可能与土壤中不稳定C底物供应的增加有关。而13个地杆菌科(Geobacteraceae)和盐厌氧菌科(Halanacobiaceae)是CK处理特有的科水平厌氧微生物。因此，我们认为CK处理中存在低氧，土壤曝气更有可能改善低氧条件，导致地杆菌科和盐生有氧菌科的消失，因此，我们认为土壤曝气更有可能改善低氧条件，从而导致地杆菌科和盐厌氧菌科的灭绝。实验室实验表明，地杆菌科的成员在将能够将有机化合物完全氧化成二氧化碳的金属还原成二氧化碳方面发挥着重要作用，其中Fe3+或Mn4+是唯一的电子受体，其中Fe3+或Mn4+是唯一的电子受体。Halanaerobiaceae通常被报导为嗜碱细菌，它可以发酵简单的有机物来产生醋酸、甲酸盐和H2。因此，我们推测，土壤曝气去除了地杆菌科和盐厌氧菌科，可能引发了土壤金属价和有机质分解的变化。曝气处理中特有的科为Porticoccaceae和Flammeovirgaceae。Porticoccaceae与芳香化合物降解有关。
图10 土壤样品和根系细菌属水平的冗余分析(RDA)。红色箭头代表根系形态指数和活性，绿色箭头代表土壤细菌属。曝气量分别为不曝气量(CK)和标准曝气量的0.5倍(V1)、1倍(V2)和1.5倍(V3)，埋管深度(D)分别为15 cm和40 cm
本研究显示根尖和番茄活性与通气量呈显著正相关(表3)。我们的结果表明，任何氧胁迫的负面影响都可以通过滴管进行土壤曝气来抵消。本研究还发现，土壤通气能有效提高根系活力。总体而言，本研究提供了通气处理能有效缓解番茄根区缺氧的证据。我们推测，增加通气量将为植物根系的有氧呼吸提供更多的氧气，这将促进植物根系的生长。
图11 番茄根系形态、活性与前50个丰富的土壤微生物群落之间的相关性。*显著在5%水平，**显著在1%水平
2 地下滴灌带埋深对根际土壤细菌和根系形态的响应
Bhattarai等人研究发现，大豆、鹰嘴豆和南瓜的产量随着滴头深度的增加而下降，这是因为灌溉和土壤通气导致的缺氧抵消了缺氧压力，导致作物产量高于没有土壤通气的作物产量。在本研究中，采用地下滴灌管向番茄根系供水和供气。也就是说，不同的地下管道埋深改变了通过管道供应给番茄根区的水和空气的深度。研究结果表明，根长、根表面积、根尖、活性与地下滴灌管埋深呈显著正相关。然而，在番茄根区没有观察到细菌序列、丰度或多样性的显著差异。在40 cm的滴灌管深度处，供水和供气的位置都在植物的主要根部以下。在这种情况下，供应的水和空气可能会导致根系沿着水和空气条件好的地区的方向生长。如表2所示，ACE与地下滴灌管的深度显著正相关。此外，不同的地下管道放置深度导致根际细菌土壤种类和OTU的差异(图5和S4)。在滴灌管埋深15 cm处的根际中检出独有的Lentimicrobiaceae。Lentimicrobiaceae是一种严格的厌氧细菌(Sun等人，2016)，证实了低氧胁迫确实存在于15厘米深度。
3 土壤曝气和埋管深度处理下土壤细菌与根系形态的相关性
土壤细菌对土壤生化和生理过程至关重要，其多样性和群落组成在决定这些过程中起着关键作用。大量研究表明，植物根系、土壤细菌和土壤性质之间的相互作用通过促进或抑制土传病原体、土壤有机质分解以及养分循环和利用来调节植物表现。根区的黄单胞菌(Luteimonas)、分枝杆菌(Mycobacterium)和热单胞菌(Thermomonas)与根长、根表面积、根叉数、活性呈负相关(图11)，红假单胞菌与根尖和根活性呈负相关(见图11)。一般来说，根叉、表面积和活性越高，从土壤中吸收养分的面积就越大。这表明，番茄根区的低土壤通气性导致了黄单胞菌、分枝杆菌和热单胞菌的减少。研究表明，黄单胞菌(Luteimonas)与植物重要病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)有着密切的亲缘关系。分枝杆菌是一种专性的细胞内病原体，广泛分布于世界各地，而热单胞菌在厌氧条件下生长。结果表明，土壤通气性对番茄根区土壤细菌丰度有显著影响。尤其是在土壤曝气处理下，厌氧细菌和植物病原菌的丰度降低。
此外，我们还分析了根系形态与土壤细菌群落多样性的关系(图12)。Pearson相关分析表明，ACE和CHO多样性指数与根尖、表面积和根系活力呈正相关，表明土壤通气显著提高了土壤细菌群落多样性和根系形态及活性。由于土壤酶是由土壤微生物、土壤动物和植物根系分泌的，我们推测土壤水分分布的改变和对土壤微生物、土壤动物和植物根系的影响是不可避免的。土壤酶的变化反过来会影响土壤微生物、土壤养分的转化和根系的生长
结论
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