科研 | ES&T：基因组学揭示了快速砂滤、净化地表水和地下水中微生物群落组成和代谢潜力的差异(国人作品)
编译：Rivc，编辑：小菌菌、江舜尧。
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快速沙滤器（RSF）专为保留悬浮颗粒而设计，广泛用于饮用水处理中。越来越多的证据表明，RSF中的微生物过程有助于转化和去除有机碳，氮和金属污染物。本研究将微生物组成和功能特性与12种不同的RSF的处理性能相关联，这些RSF显着去除了流入的铵和锰（Mn）。元基因组学分析表明，在地下水过滤器中普遍存在化学自养或甲烷营养细菌，而在地表水过滤器中编码碳水化合物和异种生物代谢基因的化学营养细菌更为丰富。大约92％的铵转化为硝酸盐，其中Comammox Nitrospira起到了关键作用。comammox amoA的组成在地下水和地表水过滤器之间有所不同，其中进化枝A在地下水滤池占主导地位（78.0％±12.0％），进化枝B在地面滤水器占主导地位（91.9％±8.9％）。此外，我们确定了六个细菌属，在RSF中编码已知的Mn（II）氧化基因，其中假单胞菌占71.1％。这些Mn（II）氧化细菌可能会促进Mn（II）氧化，从而增加进水Mn的去除。
总体而言，本文研究对RSF中的微生物组进行了全面调查，并强调了comammox和Mn（II）氧化细菌在水净化中的作用。土壤微生物群落在人类活动引起的全球变化的生态系统响应中起着重要的作用。然而，我们目前对土壤微生物如何通过相互作用对全球变化作出响应，以及这种响应是否会受到植物群落结构变化的调节，了解甚少。在此，作者利用田间试验评估了土壤真菌和细菌群落对植物入侵、干旱及入侵-干旱组合的响应变化。此外，我们利用结构方程模型，通过相关植物群落的变化，评估了植物入侵和干旱的相对重要性。
论文ID
原名：Metagenomics unravels differential microbiome composition and metabolic potential in rapid sand filters purifying surface water versus groundwater
译名：基因组学揭示了快速砂滤、净化地表水和地下水中微生物群落组成和代谢潜力的差异
期刊：Environmental Science & Technology
IF：7.149
发表时间：2020.3
通信作者：柏耀辉
通信作者单位：中国科学院生态环境研究中心
实验设计
选择了从华南到华北八个城市的饮用水处理厂使用的12种RSF（补充图S1）。在污水处理厂中，三处使用地下水（G1-G3），九处使用地表水作为水源。此外，有3家处理地表水的工厂使用双重介质（煤或带有石英砂的活性炭），6家地表水和3家地下水厂仅使用石英砂作为过滤材料。收集了砂滤器的进水和出水，测量正磷酸盐，硝酸盐氮，氨氮，溶解的有机碳，铁和锰的浓度。样品通过0.45-μm膜过滤。测量水中的总磷（TP）和氮（TN）浓度。使用流式细胞仪测定过滤器入水和出水中的微生物量。滤料样品分别进行化学分析，核酸提取和宏基因组测序，微生物群落组成及功能注释，amoA和Mn(II)氧化基因丰度计算及含amoA或Mn(II)氧化基因菌株的基因组中心分析。
结果
图1显示了过滤后六个水质指数的变化。去除浊度是饮用水处理厂中RSFs处理效率的关键指标。在所有的RSF中，过滤后的浊度浊度单位（NTU）值均低于1（中国饮用水水质标准），表明过滤器正常运行。过滤后DOC的轻微降低（图S2）和细胞计数增加表明微生物在过滤器内部的繁殖缓慢。过滤后，NH4+-N显着下降，但TN保持不变，表明硝化作用的发生，表明反硝化和厌氧氨氮不是重要的生物。过滤器中的流程。过滤器进水和出水中的高溶解氧值（> 5.6 mg / L）以及NO3--N的增加也支持这种推测（图S2）。此外，结果表明砂过滤后铁和锰的大量去除，这可能是由于可溶性Fe（II）和Mn（II）的氧化和吸附所致。该分析表明流入的Fe和Mn被保留在过滤器中（图S3）。
图1 过滤后水质指数的变化
2 微生物群落组成和代谢潜力
对来自11个RSF的39个样品（七个来自地下水过滤器的样品和32个来自地表水过滤器的样品）的全社区DNA进行了测序，每个样品平均产生了5.7±0.2Gbp的高质量配对末端序列数据。文本S6以及表S4和S5中提供了宏基因组汇编，ORF预测和注释的详细信息。结果显示，分别有70.85％±6.37％的读数分配给细菌（70.00％±6.67％），真核生物（0.72％±0.59％）和古细菌（0.13％±0.11％）。在门的水平（图S4），变形杆菌在所有过滤器中占主导地位（49.8％±10.3％）。真核生物以Chordata为代表（0.31％±0.32％），节肢动物（0.07％±0.12％）和链霉菌（0.07％±0.06％）表示。在所有过滤器中仅观察到两个古菌门的古菌（0.07％±0.11％）和真菌（0.06％±0.03％），但丰度非常低。
确定了在所有过滤器中存在的136属。为了了解饮用水过滤器中的微生物群落组成和功能，我们调查了哪些因素（即水源与过滤器材料）是造成群落变化的重要因素。图2显示，地下水过滤器和地表水过滤器之间的微生物组成（a）和功能（b）均存在显着差异，而两种类型的过滤器材料之间观察到细微差异，因为属和KEGG途径归为同一类。通过ANOSIM在两种类型的水源（R =0.451，P = 0.01，成分；R =0.281，P = 0.028，功能）和过滤材料（R = -0.0261，P＝0.582，成分。R =-0.040，P = 0.605，功能）。冗余分析结果（图S6）表明，进水Fe，Mn，NH4+和PO43-与地下水和地表水过滤器之间的微生物群落变化密切相关。以上结果表明，水质（地下水与地表水）是影响群落组成和代谢潜力的主要因素。
进一步探讨了地下水和地表水过滤器之间确定的属丰度和潜在的代谢功能类别之间的差异（图2c）。地下水和地表水过滤器中最典型的属（丰度明显较高）是需氧的，而另一些典型的兼性厌氧属地表水过滤器。这可能是由于过滤器进水和出水中的高溶解氧（DO）水平（> 5.6 mg / L）（图S2）。地下水滤池中已鉴定属的主要营养类型为化学自养或甲烷营养。例如，硝化螺菌使用氨或亚硝酸盐，镓菌使用Fe（II），亚硝化单胞菌和硫杆菌属分别使用氨和还原硫化物作为固定二氧化碳的能源。地下水过滤器中也富含甲烷营养菌，即甲基球菌，甲基细菌和甲基单孢菌。相反，地表水过滤器的特征属是趋化营养的，所有（Gemmata除外）均表现出异源生物代谢的能力（表S6）。与此相符的是，代谢途径分析（图2d）进一步表明，地表水过滤器中的微生物携带了更高的异种代谢基因副本（例如，己内酰胺，苯甲酸酯，苯乙烯和氯环己烷以及氯苯降解基因）。在地表水过滤器中，涉及碳水化合物和氨基酸代谢途径的基因的总丰度（通过edgeR中的TMM标准化）更高。这表明与地下水过滤器中的微生物相比，地表水过滤器中的微生物更倾向于依靠有机物作为能源。
3 新型comammox驱动微生物氨氧化
为了研究在过滤过程中氨是如何转化的以及哪些微生物在该过程中起主导作用，我们将宏基因组学数据与N相关化合物的浓度联系起来。通过分析过滤后NH4+-N和NO3--N浓度的变化（图3a），我们证明氨主要转化为硝酸盐，具有线性关系（Y = 0.92X，R2 = 0.952）。观察到的NH4+-N减少与NO3--N增加之间的关系。该过程与生物氧化有关，6、52与amoA基因的丰度与进水NH4+-N之间的高度相关性相关（图3b； R = 0.793，P <0.001）。三种类型的amoA基因的丰度（图3c）表明细菌在氨氧化中占主导地位，占82.5％至100％（平均95.8％）。有趣的是，comammox amoA基因存在于所有RSF中，占氨氧化基因的3.9％至97.6％（平均64.0％），表明在氨氧化中具有重要作用。为了调查comammox物种的分布，我们进一步确定了comammox amoA基因的类型和过滤器中的丰度。comammox amoA的进化枝A和进化枝B都在RSF中被发现（图S8），但在地下水和地表水过滤器之间却分布不同（图S9和图5）。具体来说，在地下水滤池中A类占优势（78.0％±12.0％），在地表滤水中B类占优势（91.9％±8.9％）（图3d）。这表明进水特性和生态位分化决定了comammox amoA的分布。
此外，为了鉴定更高分辨率携带这些comammox amoA基因的属，我们从砂滤器的基因组中回收了comammox物种的基因组草图。总共回收了1087个去复制的元基因组组装基因组（MAGs），并且这些MAGs的平均读图百分比为67.0％。其中，有23个带有comammox amoA基因的MAG在分类学上被标记为硝化螺菌（基于基因组系统发育），并在包含amoA基因的MAG中占主导地位（66.20％±37.02％;图S11），与comammox amoA的分布一致（图3c）。这些comammox MAG共享75.0％–99.1％的相似度（ANI％），但没有通过cladeA和B枝amoA基因单独聚簇（图3e）。携带进化枝A amoA基因的Bin 19，Bin 20和Bin 21在地下水过滤器中更为丰富，而在地下水过滤器和地表水过滤器之间，其他comammox MAG没有发现显着差异。
图3 砂过滤器中的微生物氨氧化。
4 微生物锰氧化
进水Mn（II）保留在砂滤池中（图1和图S3）；然而，微生物氧化/沉淀相对于非生物作用（例如直接吸附）的相对贡献是模糊的。为了解决这个问题，我们首先在包含12 mg/L Mn（II）的培养基中培养了来自11种RSF的灭菌和未灭菌的滤材（详细信息如图S12所示）。结果（图S12）表明，去除Mn（II）主要是由于过滤材料的非生物作用。该结果引起了关于滤砂器中是否存在Mn（II）氧化微生物以及它们在去除Mn（II）中起什么作用的疑问。因此，我们进一步调查了涉及Mn（II）氧化的基因的类型和丰度。包括三个过氧化物酶基因（mopA）和九个多铜氧化酶基因（boxA，cotA，cueO，mofA，moxA，mcoA和三种mnxG类型）。结果表明，RSF中存在6个基因。其中，mcoA，mnxG和mopA和moxA（82.7％–99.9％；平均93.7％）在所有样品中占主导地位（图4）。地下水和地表水过滤器之间的Mn（II）-氧化基因分布没有观察到显着差异（图S13）。Mn（II）氧化基因丰度与进水或过滤器Mn（II）浓度之间的相关性非常弱（图S14），表明较高的Mn（II）浓度并不能丰富RSF中的Mn（II）氧化基因。
为了探索携带Mn（II）氧化基因的微生物，我们还分析了含有Mn（II）氧化基因的MAG，并回收了16个细菌吃水基因组，如表1所示。这些MAG被鉴定为6个细菌属（未分类）隶属Alpha-和γ-变形杆菌，假单胞菌占71.1％。我们发现moxA（Ga0077555）和cueO（Klebsiella_B和Enterobacter）的载体以前与这些基因没有关联。我们进一步比较了本研究中回收的假单胞菌MAGs与其他两种已知的Mn（II）氧化性假单胞菌物种的基因组（图4b）。这表明该研究中的八个假单胞菌MAG与已知的Mn（II）氧化假单胞菌物种共享> 74％ANI，并且还包含相同的Mn（II）氧化基因（表1）。这使我们能够将先前关于Mn（II）氧化的假单胞菌的发现与本研究中Mn（II）氧化的MAG结果联系起来（见讨论）。此外，八个假单胞菌MAG的丰度在不同的过滤器中有所不同（图4b）。
图4 锰(II)氧化基因(a)和锰(II)氧化的丰度(b)。
讨论
众所周知，RSF中微生物的繁殖和代谢功能会影响水生养分和金属物质的迁移和转化。然而，影响微生物群落组成和功能的主要因素以及微生物迁移和转化特定物质的机制仍然不清楚。在这里，对微生物群落的宏基因组学分析为处理地表水和地下水的砂滤池中微生物驱动的氮和锰代谢功能潜力提供了新的见解。
1 水质决定了微生物群落的组成和功能
影响RSF中微生物群落组成和功能的环境因素包括水质（图2），过滤材料类型，53和其他工艺条件。我们的宏基因组学研究结果表明，地下水和地表水之间不同的水质是影响RSFs的微生物构成和功能的主要因素，而过滤材料和操作条件是次要因素（图2）。地下水通常来自贫营养和缺氧的环境，用于生物生长的电子供体主要来自氨氮，硫化氢，甲烷或还原性铁或锰。电子受体主要是曝气产生的溶解氧。17因此，这些条件导致地下水过滤器（包括硝化螺菌，亚硝化单胞菌，Gallionella，弯曲杆菌，Hydrogenophaga和硫杆菌）中的自养微生物和甲烷氧化细菌含量很高（图2c）。但是，地表水很容易从大气中溶解氧，并从内部生产（例如植物/藻类）和河流/湖泊流入物中获得有机物。有机物可以用作微生物的电子供体。因此，与地下水过滤器相比，地表水过滤器包含更多。异养微生物（图2c）以及碳水化合物和氨基酸降解基因（图2d）。另外，由于地表水比地下水更容易被人为污染，因此地表水中会存在更多的外源生物。这导致地表水过滤器中的微生物群落对异种生物更具耐受性，并且还携带了更多的异种生物降解基因（图2d）。
2 微生物对水质影响的机理
在RSF中，微生物对NH4+-N的去除有直接影响（图3）。成熟且稳定的氨氧化菌群表现出功能上的冗余，可以适应瞬时高的氨氮负荷。在当前的研究中，细菌是饮用水过滤器中发现的主要的氨氧化微生物（图3c）。在我们的研究中，comammox对氨氧化的贡献在RSF中至关重要。但是在某些过滤器（尤其是GW）中，AOB似乎是主要的硝化微生物。这些过滤器似乎比以comammox为最主要的硝化器的过滤器接收更高的铵浓度。我们还发现，地下水和地表水过滤器之间的主要昏迷种类不同（图3d），这表明水质是影响氨氧化微生物分布和功能的重要因素。尽管先前使用qPCR的研究发现，进化枝B amoA在地下水滤池中占主导地位，但宏基因组分析表明，地下水滤池中含有更多的进化枝A amoA，而地表水滤池中则含有进化枝B amoA（图3d）。
结果表明，非生物因子和生物因子均可以影响土壤微生物群落结构。我们原以为入侵和干旱都会对微生物群落产生直接的负面影响，但我们发现入侵对微生物的丰富度有直接的正面影响。然而，与入侵相关的植物丰富度下降对微生物丰富度产生了强烈的负向间接影响。这些结果表明，由于入侵导致的植物多样性下降可能驱动微生物多样性的损失。另一方面，松树丰度和根系生物量与真菌丰度呈负相关，而细菌与真菌丰度无显著相关。土壤水分与真菌丰富度呈正相关，而与细菌丰富度无关，土壤水分通过地下生物量的负间接效应抵消了正直接效应。总的来说，植物群落被证明是土壤微生物群落中生物和非生物全球变化因素的重要中介，通过评估这些间接影响，我们可以开始梳理人为环境变化相互作用的复杂性。
在RSF中，可以通过直接化学氧化轻松去除Fe。然而，在地下水过滤器中，铁氧化细菌Gallionella和弯曲杆菌的含量相对较高（图2c）。使用二价铁作为电子供体以获得能量，并在特定条件下促进铁的氧化。Mn的去除主要取决于成熟的过滤材料的物理化学作用，而成熟过程则取决于Mn（II）氧化微生物的催化氧化作用。通过从宏基因组学数据研究Mn（II）氧化基因的丰度，发现六个已知的Mn（II）氧化基因分布在过滤器中，而与Mn的含量无关（图4）。尽管目前用于数据库构建的可用序列并不高度多样化，但结果表明，Mn（II）氧化微生物广泛分布在RSF中，并且Mn（II）的选择压力并未富集Mn（II）氧化基因在细菌群落中。此外，基于MAG分析，在基于基因组系统发育学分类标记为其他类群的5个MAG中鉴定了Mn（II）氧化基因moxA。Pedomicrobium spACM 3067是用于Mn（II）氧化研究的模型生物，其特征是在指数早期至中期，在不存在Mn（II）的情况下，它能够产生Mn（II）氧化活性。在根据基因组分类注释为其他分类单元的三个MAG中观察到了cueO基因。CueO蛋白用途广泛，可以氧化Mn（II）（体外和重组菌株）以及亚铁和有机物。值得注意的是，携带多铜氧化酶基因（mnxG或mcoA）或过氧化物酶基因（mopA）的假单胞菌被鉴定为普遍的细菌Mn（II）氧化基团。 Multicopper氧化酶基因可以直接表达Mn（II）氧化活性，但是mopA的表达可能需要严格的条件。该观察结果使我们能够通过将先前关于锰（II）氧化假单胞菌在沙滤池中的发现联系起来，探索锰（II）氧化微生物在水净化中的作用。我们之前的研究表明，在砂滤池中接种带有多铜氧化酶基因的Mn（II）氧化假单胞菌可以缩短启动时间并增强抗冲击负载能力。也有人提出，砂滤池中存在Mn（II）氧化微生物可加速Mn氧化物的形成并抵消Mn氧化物在滤池中的还原溶解。之后，过滤器可以通过氧化或吸附促进金属和有机物的去除。总体而言，这些RSF中Mn（II）氧化微生物的存在促进了进水Mn和其他污染物的去除，这些污染物可被Mn氧化物吸附和/或氧化。
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