科研 | Nature：单细胞转录组揭示3D培养的人类原肠前胚胎的发育情况(国人佳作)
编译：不二，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos
译名：3D培养的人类原肠前胚胎的发育情况
期刊：Nature
IF：43.07
发表时间：2019.12
通讯作者：李天晴和季维智
通讯作者单位：昆明理工大学灵长类转化医学研究院
DOI号：10.1038/s41586-019-1875-y
实验设计
样本来源及3D培养系统的开发：在获得严格的伦理审核和病人知情同意的条件下，利用临床上捐献的胚胎，通过改善培养基和培养方法，开发了一个3D人囊胚培养系统，克服2D方法无法模拟胚胎发育的缺陷。使用形态学观察以及冷冻切片染色，观察3D培养的胚胎中的3D结构。
单细胞测序：使用0.25%的胰蛋白酶将胚胎分离成单细胞，经过洗涤和离心，移入PCR管中。所有操作都经过显微镜观察监测。分别使用Illumina X-ten和BGISEQ-500平台进行单细胞测序。
数据分析：测序数据经过质控和严格过滤后，使用HISAT2（v2.1.0）软件比对到人类参考基因组上，使用Stringtie（v1.3.4）和Qualimap（v2.2.2-dev）软件进行基因表达量及测序reads数的计算，使用R语言Seurat（v2.3.4）进行t-SNE分析鉴定细胞簇，使用R语言Monocle（v2.4.0）进行时间轨迹分析。
GO及KEGG分析：利用KOBAS3软件对不同细胞类型表达的基因进行GO及KEGG分析，得到的显著性结果使用R语言ggplot2进行作图。
分子调控网络分析：使用Cytoscape（v3.6.1）进行PluriNetWork分析。
结果
3D培养的胚胎中的3D结构
借助捐赠的临床IVF剩余的人类胚胎，研究人员检测了2D人胚胎培养的培养基IVC1和IVC2是否适合3D囊胚培养。使用胚胎形态学观察，这些培养基在受精后第14天（dpf14）仅仅可以维持6.3％的胚胎。然后，向IVC1和IVC2培养基中分别添加了乳酸钠、丙酮酸钠和ROCK抑制剂（Y27632），并分别命名为mIVC1和mIVC2。在dpf14，mIVC1和mIVC2培养基可维持23.4％的人类囊胚。
然后，研究者设计了一系列添加Matrigel的3D细胞外基质，来开发理想的3D囊胚培养系统。使用形态学观察和染色检测了特定细胞谱系标记基因的胚胎发育，OCT4用于鉴定内部细胞团（ICM）和上胚层细胞（EPI），GATA6用于鉴定原始内胚层/下胚层细胞（PrE），CK7用于鉴定滋养层细胞（TrB）。观察到添加10％的Matrigel可以产生最佳结果，并使23.5％的囊胚发育到dpf14并具有正常的胚胎结构。研究者将10％的Matrigel与mIVC1和mIVC2结合使用来培养囊胚（图1a）。
形态学观察表明，可以使用3D平台培养人类囊胚到dpf14（图1b）。几乎所有囊胚在dpf5-6均呈GATA6阳性，但CK7呈阴性，而ICM表达OCT4、NANOG、KLF17和PRDM14（图1c，d）。在dpf7或8，GATA6、CK7和OCT4显示出互斥的表达（图1e，f），这表明EPI、PrE和TrB细胞的分子和物理特性更高。TrB细胞表现出强烈的丝状CK7染色（图1f）。EPI开始极化并径向重新排列（图1f）。在发育过程中，人卵黄囊（YS）有两个发育阶段：在dpf7和9之间形成初级卵黄囊（PYS），然后在dpf12-13形成次级卵黄囊（SYS）。我们观察到小PYS被GATA6+PrE包围（图1f）。在dpf10，通过足细胞标记蛋白（PODXL）观察到放射状排列的分布，这指示了EPI的极性和上皮化（图1g，h）。我们还检测到了不同的PYS（图1g）。在dpf12，羊膜腔（AC）被薄鳞状的羊膜上皮细胞（AME）与柱状的EPI分开（图1i）。相反，2D培养的胚胎中的AC和YS在此阶段会出现崩坏。在2D培养的胚胎中未观察到明显的AME-EPI分离。
在dpf14，胚胎的直径和厚度分别超过500μm和400μm。胚胎双层杯盘以明显的SYS保持连续生长（图1j）。作为类人猿灵长类动物的一个显著特征，SYS由不规则的腔内内胚层（VE）和鳞状的上皮内胚层（PE）组成（图1j，k），这与猴和人类dpf13-14胚胎的体内解剖学描述一致。鳞状的PE表达GATA6（图1k），表明它们起源于PrE，并在植入后迅速产生VE和PE。胚胎表现出3D球形结构，具有双层杯盘结构、SYS和羊膜，并且TrB位于胚胎的羊膜侧，使滋养层细胞开始分化，并经历空间和不对称发育以集中在羊膜侧。总之，本研究的3D平台可以像人类胚胎一样诱导空间结构自发组装。
图1 3D培养的胚胎中3D结构自发组装。
通过转录组解析细胞谱系
在7个发育阶段对42个胚胎进行了557个单细胞RNA-seq（scRNA-seq），获得3D培养的胚胎转录组（图2a）。经过质控和过滤，研究者将具有23270个基因的555个单细胞用于后续分析。t-SNE分析揭示了7个细胞簇，根据细胞谱系特异性标记基因的表达和发育时间可分为：ICM、EPI、PrE、TrB（包括CTB、STB和EVT）和PSAEPI（图2b-d）。dpf6到14的连续转录组反映了植入前到植入后的过渡（图2d）。来自不同胚胎的scRNA-seq数据的综合分析显示，在所有样本中，人类dpf6囊胚中发生细胞谱系隔离，但不完全，并且细胞命运似乎固定在dpf7-9胚胎中。因此，研究者在dpf7-9的3D胚胎中利用scRNA-Seq鉴定了分离TrB、PrE和EPI的调节基因。研究人员观察到与不同的信号通路和转录因子（TF）相关的EPI、PrE和TrB特异表达基因。Petropoulos等人的结果与本研究结果之间的细胞谱系特异性基因的比较表明，不同样品之间保持了核心细胞谱系TF，而胚胎发育的不同阶段可能会造成基因表达的某些差异。
图2 scRNA-seq鉴定细胞谱系。
AME-EPI分离
与小鼠EPI相比，灵长类动物中的近端EPI在原肠胚形成前分离出了另外的AME细胞谱系。但是，在缺乏良好分子标记的情况下，人类AME仍不清楚。由于组织形态发生需要细胞间粘附蛋白，研究者观察到E-钙粘蛋白在柱状EPI的细胞膜上的对称分布，而鳞状AME则没有显示E-钙粘蛋白的弱表达。但是，在人类EPI中广泛分布的E-钙粘蛋白，在小鼠中却集中在楔形EPI的顶端。羊膜的形成需要来自VE产生的基底膜（BM）的信号。PrE和EPI之间的表层形成了包含层粘连蛋白的BM，包围了EPI，但没有包围AME。AME中的OCT4、NANOG和SOX2表达较弱。在dpf6和8，E-钙粘蛋白普遍分布在EPI和TrB细胞膜上，而层粘连蛋白包裹了整个EPI细胞簇，并在TrB中广泛表达。在dpf10，层粘连蛋白在EPI周围集中并形成BM，但在AME中丢失。
接下来，检测了ERIZN和WGA的表达，它们位于hPSC来源的羊膜顶端表面。ERIZN同样在EPI和AME的顶端表面表达。但是，WGA在胚外细胞中表达，在EPI和AME中不表达，这表明3D胚胎和hPSC来源的羊膜之间存在差异。由于AME-EPI的明显分离发生在dpf12和14，研究者分析了来自dpf12和14 EPI的scRNA-seq中的后EPI细胞簇（图4a）。基于它们的基因表达谱t-SNE将这些EPI分为三个细胞簇，分别为AME、中间状态细胞和EPI。与EPI相比，AME表现出多能性基因的显著下调，和在dpf12-17猴胚胎（TFAP2C、MSX2和BMP4）或人类PSC的自发组装羊膜（TFAP2A和GATA3）的AME中表达的基因上调。AME中激素基因的高表达与产生hCG的人类胎盘AME相对应。这些结果表明，与EPI相比，AME是具有特定表型的独特细胞群体。
前后轴和PSA的形成
原条（PS）的定义不清，仍是人类胚胎中的神秘结构。PS形成的一个标志是上皮-间充质细胞的转化和N-钙粘蛋白（一种间充质细胞标记基因）的上调。研究人员发现N-钙粘蛋白（CDH2）位于dpf12之前的PrE中，并在EPI外部或dpf14的AME-EPI交接处的一些表达OCT4的细胞中被激活（图3a，b）。这些结果由scRNA-seq数据所证实（图2c）。
在小鼠胚胎发育过程中，前轴VE（AVE）分泌LEFTY1和CER1拮抗后轴的形态发生，而OTX2调节AVE和前后（AP）轴。研究人员观察到一些表达T-box转录因子（T）的EPI，它是PS的早期标记基因，但在dpf14的AME附近的EPI边界处OCT4的表达受到了抑制。尽管研究人员没有观察到EPI中SOX2（前轴）和NANOG（后轴）的互斥表达，但在dpf14胚盘的一侧观察到了CER1、LEFTY1和OTX2的表达（图3d，e），表明AVE形成。与在小鼠胚胎细胞中相反，OTX2在3D胚胎的PrE中表达。表达T-box转录因子的EPI的位置与AVE相反（图3d，e）。
接下来，检测了HESX1的表达，它是上胚层细胞、早期前轴分化或VE的标记基因。研究人员观察到HESX1在dpf12的EPI中均匀表达。某些EPI不表达HESX1，但在dpf14时T-box转录因子（T）表达上调（图3f）。此外，T-HESX1+和T+HESX1-的EPI定位于EPI的相反两侧，分别代表前后轴EPI。scRNA-seq显示PSA-EPI中的HEXS1表达下降（dpf14）。在dpf14的EPI产生两个细胞群体分支：T-HESX1+细胞和T+HESX1-细胞，这进一步定义了前后轴细胞的命运。T+HESX1-的EPI富含后轴和PS基因，而T-HESX1+的EPI显示出早期前轴基因上调。
对整个胚胎进行连续切片，研究人员观察到一些dpf14胚胎形成了一个细胞扩散区域，其中一些T+EPI从胚盘集中迁移，破坏了PrE（表达N-钙粘蛋白）形成屏障，侵入了靠近VE的区域和与GATA6共表达（图3g，h）。FLK1（KDR）是胚外中胚层的标记基因，在EPI中高表达，但在胚盘迁移的T+细胞中丢失，表明后者不是胚外中胚层。一些FLK1+细胞位于PrE和TrB之间，表明这是胚外间充质细胞。与后EPI（植入后EPI）相比，PSA-EPIs中PS基因显著上调。但是，缺乏神经基因的表达，表明dpf14胚胎尚未发育成可产生初始神经系统的细胞。研究人员推测dpf14胚胎处于PSA阶段，这符合国际公认的人类胚胎培养的道德极限。总之，研究者认为一部分dpf14的EPI发生了变化，并引发了AP轴和PS的形成。
连续的细胞增殖是评估胚胎发育状态的关键。2D培养胚胎中的细胞增殖仅在dpf8-10之间，这意味着2D胚胎不能存活超过14天。3D胚胎在所有阶段均保持EPI、TrB和PrE的持续增殖。研究者预测持续的细胞增殖可能会促进人类胚胎发育至dpf14以上以形成原肠胚。
图3 人类胚胎显示前后轴和PSA的形成。
滋养层细胞谱系的发育
人胎盘由三个主要的TrB细胞亚群组成：细胞滋养层（CTB）、绒毛外滋养层（EVT）和合胞体滋养细胞（STB）。在本研究的3D培养胚胎中，EPI和PrE周围的TrB呈现F-肌动蛋白的极化分布。EPI-PrE双层附近的CK7+细胞具有一个表达TEAD4和CDH1（E-钙粘蛋白）的单核细胞，这表明CTB的身份。与AME相邻层中的多核细胞表达了hCG，这表明STB的身份。一个外层细胞群在dpf12胚胎中高表达EVT标记基因HLA-G，并在dpf14胚胎中显著上调。大多数细胞中的hCG、TEAD4和HLA-G的互斥表达，显示了三种TrB细胞类型在dpf12-14的分子和物理特性。
使用scRNA-seq数据鉴定了ICM和所有TrB中前2603个差异表达基因。根据发育时间和标记基因，t-SNE分析将其分为6个细胞群：Pre-CTB（TEAD4+HLA-G-）、Post-CTB、早期STB（CGB+CSH-HLA-Glow）、STB，早期EVT（HLA-G+CSH1+MMP2+ERBB2+）和EVT。从dpf6到14连续的转录组揭示了逐步的发育进程，其中CTB产生了EVT和STB，并且在dpf9开始分离，并在dpf12完成分离。有趣的是，由于人外周植入胚胎和滋养层干细胞中没有CDX2表达，在dpf7的TrB分化后，CDX2表达迅速下降。
由于人类胎盘必须分泌类固醇或多肽激素来维持妊娠，因此研究者分析了TrB产生的120种多肽激素基因的表达。主要产生胎盘激素的STB从dpf8开始表达31种激素基因。EVT表达19种多肽激素基因，并在整个培养过程中表达上调。EVT中CGA、CGB和PGF的表达表明，原肠前EVT可以分泌hCG、孕酮和雌激素。但是，这些基因在W8-EVT中显著下调，在W24-EVT中完全消失。因此，EVT分泌激素的能力随着胎盘的发育而逐渐降低。
接下来，鉴定了与不同TrB细胞亚群相对应的基因。CTB、STB和EVT特异表达的基因与其功能和特定信号通路密切相关。EVT特异表达的基因有助于调节免疫系统和血管生成。这些结果证实人类孕早期胎盘中的EVT对于早期母胎的免疫调节和螺旋动脉重塑至关重要。我们阐明了调控TrB发育的转录因子。CTB、STB和EVT的转录因子包含了已报道的TrB和多能性转录因子以及新的潜在转录因子，例如MYBL2、TCF7L1和NR2F2。
上胚层细胞的发育与转变
分析了整个发育过程中的EPI转录组动态，揭示了四个主要细胞簇：ICM、Pre-EPI（植入前EPI）、Post-EPI和PSA-EPI（图4a，b）。当追踪naive和primed的多能性基因表达时，发现胚胎在植入后丢失了naive基因TFCP2L1、KLF17和KLF4的表达，并激活了primed的基因CD24的表达，但同时保留了总体的多能性基因表达。scRNA-Seq数据证实了EPI多能性状态转变（EPST）。
通过使用现有的小鼠数据库进行Pluri-NetWork分析，研究人员推测了来自不同发育阶段的EPI是否显示出不同的多能性分子调控网络。主要多能性调节基因的不同组合主导和协调了EPST分子网络。naive多能性基因（ESRRB、KLF4和TFCP2L1）仅占据ICM分子网络，这表明人类EPI在细胞谱系多样化后迅速失去naive多能性，这与猴EPI一致，仅在后期和孵化囊胚阶段之前短暂表达naive多能性基因。不同发育阶段EPI的特异表达基因显示，EPI从植入前到植入后均保持稳定的转录组，在Pre-EPI转变和PSA起始阶段发生了剧烈的基因表达变化（图4c）。不同的EPI多能性状态由不同的转录因子和调节的信号通路所主导（图4c）。
为了比较食蟹猴和人EPI的发育，分析了来自食蟹猴dpf6-17 EPI的scRNA-seq数据。主成分分析（PCA）揭示了食蟹猴和人类细胞沿PC1分离，这代表了主要的物种差异。鉴定了食蟹猴和人类基因显著阳性或阴性PC1得分的基因。沿着PC2和3轴对食蟹猴和人EPI细胞作图，结果显示它们相似的发育转变以及保守的信号通路和GO特征。为了鉴定物种差异，研究者比较了人类和已报道的猴数据中EPST的naive基因和信号通路的动态变化。与人EPST相反，在猴的EPST过程中TBX3和SOX15逐渐降低，而UTF1和NR0B1不表达（图4c）。EPST过程中上调基因的信号通路分析表明，人和猴的NOTCH、BMP和FGF信号通路具有相似的富集趋势。但是，BMP信号通路中的LEFTY1、LEFTY2和NODAL，在人和猴EPST之间显示出不同的表达模式。人和猴的EPI在发育过程中具有独特的表型和相似性。
图4 EPI细胞谱系的发育。
结论
本研究开发了一个3D培养系统，该系统成功地培养了人类发育到PSA阶段的囊胚。这些3D胚胎可以概括体内原肠前胚胎的几乎所有关键3D结构和发育进程。相比之下，使用2D培养胚胎的体外植入平台和模拟早期发育胚胎的hPSC并没有发现许多3D结构和发育标志，例如AME-EPI分离、BM、SYS、AVE、AP轴和PSA。该3D培养胚胎概括了细胞谱系分离和发育的时间和结果，更真实地模拟了人类体内早期胚胎的发育。
评论
由于尚未很好地了解人类胚胎发生，研究人员建立了一个平台来描述EPI、AME、PrE和TrB。揭示了AME的独特特征，它是从不断扩大的EPI细胞群体中出现的第一个分化的细胞群。研究者发现了TrB细胞亚群分离的特定信号通路和转录因子，以及细胞亚群间和原肠前TrB和胎儿TrB间的功能差异。与小鼠不同，人类EPI植入后可以稳定并长期保持其转录特性，同时获得神经元分化和脉管系统发育的特性。总的来说，本研究揭示了人类原肠前胚胎的分子和形态发生发育动态。这些数据提供了深入的见解，可以更好地了解人类PSC的多能性并揭示干细胞的自我更新和分化过程，为将来提高体外受精成功率的研究提供了重要的参考价值。
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