编译：小北，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
磷酸三苯酯(TPP) 在各种环境介质和生物群中均有发现，说明人类对其接触广泛。然而，TPP暴露对肝毒性健康风险的信息仍然缺乏。在本研究中，TPP能够诱导人类正常肝细胞(L02)凋亡、损伤细胞亚显微结构并且提高ROS的水平。多基因组学(转录组、蛋白组学和代谢组学)整合分析被用来进一步研究机制。转录组学分析发现TPP暴露能够显著影响细胞凋亡、促癌基因的活化、氧化还原内稳态以及DNA损伤和修复。此外，蛋白组学分析发现与凋亡、氧化应激、代谢和膜结构相关的基因受到影响。代谢组学证实代谢的信号通路，包括糖酵解、柠檬酸循环、氧化磷酸化、脂质和蛋白代谢受到严重破坏。基于多组学的结果研究者构建了一个假说网络，旨在发现TPP应答中关键的细胞内事件，并且阐述TPP诱导L02细胞肝毒性的机制。因此，分子应答可以在多个生物学水平阐明并且多组学的分析能够为探究毒性的相关机制以及化学风险评估提供科学的工具。
原名：Transcriptomic, proteomic and metabolomic profiling unravel the mechanisms of hepatotoxicity pathway induced by triphenyl phosphate (TPP)
译名：转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析揭示了磷酸三苯酯（TPP）肝毒性途径的机制
期刊：Ecotoxicology and environmental safety
影响因子：4.872
发表时间：2020年8月18日
作者：Huifeng Wu
单位：中国科学院海岸带环境过程重点实验室
DOI：10.1016/j.ecoenv.2020.111126
有机磷阻燃剂(OPFRs)的用量增加并且到2015年将达到680 kts。基于实验证据以及预测模型OPFRs在环境中持久存在，并且广泛积聚在大气、雪、海水以及生物群中，甚至是在极地地区以及遥远的海洋，因此引起公众的关注。磷酸三苯酯(TPP)作为一种亲脂性的OPFRs，不能与聚合物化学结合，因此增加了TPP向空气中释放。越来越多的研究发现TPP能够导致神经毒性、基因毒性以及内分泌干扰效应。TPP能够导致日本鹌鹑胚胎生长和休息代谢速率减弱。环境中TPP的浓度也会影响中枢神经系统的发育，导致早期斑马鱼幼虫的神经毒性。因此进一步研究TPP深层毒理学机制是非常必要的。肝脏是机体内重要的代谢器官，在酶的合成以及异生污染物的移除中发挥重要作用。肝细胞在维持代谢的平衡以及污染物毒性中发挥作用。然而很少有报道研究OPFRs对肝脏的毒性效应。TDCPP以及TCEP能够显著增高大鼠肝脏的重量。TDCPP以及TCPP能够影响鸟肝细胞脂肪代谢。TBOEP、TCIPP、TCEP以及TDCPP能够导致肝完整性和身体功能的适度变化。此外，Reddam等人发现TPP对斑马鱼胚胎肝毒性相关信号通路具有很大的影响，并且认为肝脏是TPP潜在的靶向器官。鉴于此，需要进一步研究TPP肝毒性的机制以及毒性反应信号通路。由于生物是一个复杂的系统，通过传统毒理学的方法并不能够检测TPP的毒性。因此，在毒理学研究中组学工具被广泛应用，提高对化学机制的理解并且改进预后不良。将转录组学、蛋白组学以及代谢组学整合的方法能够分析代谢的分布、探究相关的酶和蛋白并且解释毒性的机制。在本研究中，传统毒理学与组学技术结合阐释了TPP诱导的肝毒性潜在细胞内机制。TPP暴露24h后，暴露在低浓度TPP (10-8, 10-7, 10-6-, 10-5 M)中的L02细胞增殖显著提高(p < 0.05)。然而，更高浓度的TPP(10-4, 10-3 M)能够抑制细胞的增殖。如图1A观察到的TPP毒物兴奋效应对细胞增殖的影响。在接下来的实验中，TPP两个典型的浓度10-6M、10-4 M分别作为高浓度抑制和低浓度刺激的效应进一步进行组学分析。TPP暴露10-6M以及10-4 M 24h后，通过流式检测L02细胞的凋亡和ROS水平。与对照组相比，依据阳性剂量效应关系，TPP能够显著影响L02细胞的凋亡（图1D）。在10-4 M TPP处理组中凋亡率显著高于对照组(p < 0.01)。与对照组相比，TPP处理组中ROS的水平显著升高(p <0.05)（图1B）。研究者采用qRT-PCR测量不同浓度TPP中凋亡相关基因(Bcl-2, Bax, Bad, Hrk, Bcl-xs, Caspase 7 以及p53)的mRNA水平。在10-4 M TPP处理组中Bcl-2, Hrk以及Caspase 7的表达显著升高(p < 0.01)，而Bax和p53的表达下调(p < 0.05)（图1D）。在10-6M TPP处理组中，Bad和Caspase 7的表达显著上调(p < 0.05)，而Bcl-2和Hrk的表达下调(p < 0.05)。为了分析TPP对L02细胞结构的影响，研究者通过TEM技术对对照和TPP处理组进行石蜡包埋切片。TEM分析发现TPP处理组中的L02细胞细胞膜损伤、细胞间隙空泡化以及线粒体收缩、自噬（图1C）。线粒体的结构损伤可能导致线粒体功能受损。总之，TPP主要影响膜的完整性以及线粒体的结构。高浓度TPP（10-4 M）处理以及DMSO对照经过|log2 (fold-change)| > 0以及调整的p< 0.05筛选后共有8879个差异表达的基因。火山图谱显示在这些差异基因中4636个基因显著上调并且4243个基因显著下调（图2A）。富集的KEGG信号通路主要包括蛋白合成和代谢、癌症、细胞活性、氧化还原状态以及DNA损伤修复系统（图2B）。图2 受TPP影响L02细胞中差异表达的基因及其富集的信号通路将L02细胞暴露在10-6M以及10-4 M TPP中，通过MALDI-TOF-MS/MS光谱证实14个蛋白显著改变(>1.5-fold, p < 0.05)。代表性的2-DE凝胶样本如图S1所示，并且筛选的蛋白信息汇总在表S3中。在低浓度TPP（10-6M）处理样本中7个差异表达的蛋白下调，包括chain A、GLO1、EEF1D、PGK1、ACTA3、HCORO1、PSMC1以及PSMA1。这些差异表达的蛋白与物质代谢和糖酵解、RNA翻译、细胞运动以及骨骼相关。当暴露在高浓度（10-4 M）TPP时，有另外7个显著变化的蛋白，其中1个蛋白（AKR）上调，6个蛋白（APE1、GLRX3、HSP90B1、SET、DLD以及PSMA1）的表达下调。这些蛋白与细胞凋亡、膜结构、物质代谢以及氧化还原状态相关。为了探究这些蛋白间复杂的相互作用并且预测信号通路，研究者进行了可见的蛋白与蛋白相互作用网络PPI。利用细胞镜鉴定这些蛋白(DEPs和p53)存在可视化的蛋白-蛋白相互作用（图3）。网络分析发现细胞氧化还原内稳态、细胞死亡的调节以及丙酮酸代谢过程受到影响。APE1, PGK1以及p53参与多个功能，包括DNA修复以及细胞癌变的毒物刺激，已被认为是新兴的靶点。APE1蛋白的表达在细胞对氧化刺激反应中发挥核心作用，研究者发现在10-6M TPP处理组中其表达升高，而在10-4 M TPP处理组中降低(p < 0.05)。TPP能够调节氧化还原的平衡并且阻止DNA损伤。高剂量的TPP（10-4 M）能够导致APE1的下调，这将影响细胞对DNA损伤作出应答。细胞肿瘤抗原p53能够通过抑制Bcl-2的表达诱导凋亡。P53蛋白的表达下调以阻止损伤的DNA修复并且诱导细胞死亡。在糖酵解中的一种酶PGK1在低浓度TPP（10-6M）处理组中下调，并且在高浓度TPP（10-4M）处理组中上调。PGK1参与细胞代谢调节以及DNA修复。PGK1蛋白的表达在10-6M TPP处理组中下调，提示TPP能够干扰L02细胞代谢，而在10-4M TPP处理组中细胞内高表达的PGK1与肿瘤的发生发展相关，并且导致肿瘤细胞增殖。应激源诱导的细胞内代谢应答信息可直接通过代谢组学分析鉴定。代谢组学广泛应用于对污染物诱导毒理学效应的阐释。在对照组中L02细胞1H NMR光谱在图S3中展示。基于1H-NMR代谢组学在TPP处理组中共检测出16个差异改变的代谢物，包括乙醇，乳酸，丙氨酸，谷氨酸，4-氨基丁酸，牛磺酸、甜菜碱、肌醇、反式4-羟基脯氨酸、谷胱甘肽、磷胆碱、天冬酰胺、甘氨酸以及NAD+和NADP+（图4A）。在低浓度（10-6M）TPP处理组中，乙醇和乳酸的水平升高而4-氨基丁酸，丙氨酸和天冬酰胺含量降低（图4A、表1）。在高浓度（10-4M）TPP处理组中乳酸、丙氨酸、牛磺酸、甜菜碱升高，而4-氨基丁酸降低。代谢组学信号通路从观察到的代谢图谱中洞察分子机制。改变的代谢物富集的信号通路富集有谷胱甘肽代谢，葡萄糖-丙氨酸循环，氨循环，谷氨酸代谢，烟酸和烟酰胺代谢，蛋氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(图4B)。L02细胞TPP的肝毒性机制通过整合转录组学、蛋白组学和代谢组学的方法进行分析。结果发现TPP能够击碎膜磷脂，导致ROS产生，并且活化细胞线粒体凋亡信号通路。在多个生物学水平上，TPP能够活化促癌基因、损伤DNA、破坏氧化还原失衡以及代谢诱导肝毒性。本研究说明多组学的方法联合将提高对环境污染物的毒性途径的理解。
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