综述 | TREND ANAL CHEM：基于核磁-质谱稳定同位素分辨的代谢组学及肿瘤代谢应用
编译：cell_ysc，编辑：Emma、江舜尧。
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疾病的代谢重编程近来引起人们极大的兴趣，被认为是新一代癌症的标志。尽管放射性同位素标记技术在早期代谢研究中处于主导地位，稳定同位素示踪结合现代高分辨质谱与核磁技术才真正实现了系统性绘制人体细胞、组织、器官内的代谢网络与代谢流。这些分析平台在化合物鉴定与定量、高通量代谢物追踪等信息上高度整合、互证互补。此外，化学选择性衍生化与原位波谱学的发展也使实时监测不稳定/低丰度代谢物及其代谢动力学研究成为可能。本文将针对稳定同位素分辨的代谢组学(SIRM）及其在肿瘤代谢研究中的应用及未来展望做一综述。
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内容
同位素示踪技术在代谢研究中历史悠久。由于放射性同位素易获取且检测灵敏，因此在研究初期应用更为广泛，如中心(如Kreb循环)与次级代谢途径的发现。然而稳定同位素标记无害、在人体研究中更具操作性，且可通过核磁(NMR)与质谱(MS)分析。借助现代分析仪器，这一古老的技术在代谢研究中逐渐复兴，自2000年以来，已有超过1300篇肿瘤代谢相关文章使用了稳定同位素标记技术。这种基于稳定同位素标记试剂与代谢组学技术联合高分辨质谱与结构表征核磁的方法统称稳定同位素分辨的代谢组学(SIRM)。图1展示了SIRM在不同生物系统中的研究框架，总体上形成了一套完整的生化分析流程。由于SIRM严格并系统地追溯代谢网络，极大弥补了我们对于人类疾病中细胞与组织代谢途径传统认识的不足。
稳定同位素的原子核内附加中子，这使核磁与质谱分析变得简单。稳定同位素如13C可直接被核磁共振检测，而单体如12C、除3H外的放射性同位素在核磁共振中均无信号。另一方面，代谢物中质子的化学位移与耦合现象也使15N、13C等信号能被更灵敏地间接检测。然而自然界中本身存在低丰度的稳定同位素：如13C 约占12C的1.1%(12C约占C丰度的98.9%， 13C比12C重约1Da)、15N约占14N的0.35%、2H约占1H的0.02%。又由于13C与15N、2H等附加中子质量略有不同，经典分辨率质谱不能区分同一样品中两种或更多的标记原子。近来超高分辨-傅里叶变换质谱(UHR-FTMS)的发展使质荷比(m/z)精度达到小数点后五位，因此可进行多重稳定同位素分辨的代谢组学(mSIRM)研究(图2)。
核磁与质谱这两种有力的技术交互，在确认同位素代谢物的浓度与结构(尤其在区分同位素异数体、同位素异位体)上提供了严谨而全面的信息。尽管二者物理学原理完全不同，但通过合理的实验设计并结合二者信息，可有效地对未分级细胞、组织、器官等样品中的代谢转化途径及代谢流(速率和/或流向)进行分析。
此外，核磁共振的另一个优势在于活体或原位监测代谢途径与代谢流。传统原位核磁技术通过31P NMR确定ATP、无机磷酸盐，磷酸糖、磷酸肌酸水平及ATP的转化率和胞内pH值。近年来，稳定同位素标记，特别是与新的超极化方法(如动态核极化，即DNP)结合，已开始用于动物及人体内短途代谢通路高灵敏追踪。
代谢研究中最常用的稳定同位素是13C。含13C的商业化前体分子有很多：D-葡萄糖(如[U-13C], [13C-1,2], [13C-1,6], [13C-3,4])可用于研究糖代谢途径；13C-辛酸、13C-棕榈酸、13C-乙酸可用于研究脂代谢途径；此外，还可监测胞内13C-乙酰辅酶A、13C-果糖、13C-氨基酸等。15N-氨基酸、双标记分子(如[U-13C,15N]-谷氨酰胺)在SIRM中也较常见。庞大的稳定同位素标记分子库为错综复杂的代谢网络研究开辟了广阔的道路。表1总结了部分常用的商业化稳定同位素标记分子及其追踪的代谢通路。
3. 稳定同位素标记代谢物的选择性检测
磷是重要的生物组成元素，其同位素31P的天然丰度接近100%。它是自旋½核，旋磁比接近氢核的40％，因此适合于核磁检测。而要想对复杂代谢物选择性检测，便可引入含有13C、15N同位素标记试剂。目前最简单的方法即氢磷异核单量子相干(1H{31P}-HSQC)实验。一方面通过只检测绝大多数磷酸化代谢物中存在的31P-O-CH耦合信号，大大简化了未分级复杂生物样品的解谱；另一方面，HSQC可以得到质子分辨率更高的信息。然而，仅凭单一方法实现复杂代谢物的准确鉴定非常困难。异核单量子相干-全相关谱(HSQC-TOCSY)方法更有利于全面地鉴定代谢相关网络中的磷酸化代谢物。这是由于TOCSY可以找到同一偶合体系中所有氢核的相关信息，包括13C上带有的额外质子，而这些信息是难以通过质谱定量获得的。
事实上，同位素异数体与同位素异位体表征了不同的代谢来源，暗示了他们的代谢来源与功能并不相同。因此代谢物的“生物合成史”很大程度暗含在了核磁-质谱对化学基团的鉴定信息中。然而标记代谢物种类过多引起复杂的波谱拥挤，不利于分辨核磁与质谱信号归属。而化学选择性衍生化方法便可降低波谱拥挤、增强核磁与质谱的检测效果。一些化学选择性探针被报道，如乙醇胺用于羧酸盐基衍生化，N-(2-15N-氨基氧乙基)-N,N-二甲基-1-十二烷基胺(QDA)用于醛酮衍生化，N-(2-15N-碘乙酰胺基)-N,N二甲基-1-十二烷基胺(QDE)用于巯基衍生化，氯甲酸乙酯(ECF)用于氨基、羟基、羧基衍生化。每个化学选择衍生化试剂在官能团上带有一个或几个可被波谱区分的标签辅助核磁与质谱对代谢物的鉴定与定量。比如，QDA和QDE探针带有一个永久正电荷，适于离子化被质谱检测(图3)。将稳定同位素标记的QDA和QDE(如13CD3-QDA）和未标记探针1：1混合与代谢物反应后通过UHR-FTMS分辨m/z差值为4.02188，便简化了羰基和巯基代谢物的鉴定与定量(图3)。
此外，化学改造的15N-氨氧基的QDA探针，通过与羰基代谢物如丙酮酸反应生成酮肟(图4A)。由于加合物中15N与相邻质子形成三个键的耦合，因此可以进行一维和二维核磁HSQC检测，而非标的传统核磁共振氢谱检测则难以分辨(图4B,C)。因此，化学选择性衍生化方法结合稳定同位素标记有助于通过核磁-质谱分析复杂样品中的低丰度代谢物。同时，衍生化方法也为核磁与质谱分析不稳定代谢物(如4-羟基壬烯醛)及挥发性代谢物(如丙酮)提供了可能。
图4 化学选择性衍生化羰基代谢物的核磁共振检测
4. SIRM在肿瘤代谢研究中的应用
目前人们已经意识到，代谢重编程是肿瘤生存的重要法则之一，因此稳定同位素标记实验在肿瘤代谢领域被频繁应用。许多代谢紊乱使正常细胞向高度增殖性癌细胞转化，这些代谢上的改变通常与关键癌蛋白和/或抑癌蛋白改变所驱动的转录程序变化相互作用。此外，越来越“敌对”的肿瘤微环境可进一步促进代谢重编程以加速肿瘤生长。多数实体瘤糖酵解途径上调，消耗大量葡萄糖并转化为乳糖，释放质子酸化胞外环境(即瓦博格效应）。癌细胞为了维持增殖、存活与最终转移，其部分代谢途径必然随之上调，尤其是参与了某些核酸、脂质、复合糖与蛋白质生物合成的相关途径，例如嘌呤生物合成与一碳代谢(丝氨酸、甘氨酸)、嘧啶生物合成(天冬氨酸)、脂质合成(柠檬酸)、糖原合成(UDP-葡萄糖)、蛋白质合成(一些非必需氨基酸如丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸等)、抗氧化谷胱甘肽合成(谷氨酸)等。近来已有研究表明，对于必须氨基酸的代谢，尤其是支链氨基酸如异亮氨酸、亮氨酸于缬氨酸对一些肿瘤发展进程十分重要。
通过追踪细胞系及器官中13C-葡萄糖摄取与13C-乳糖生成水平、占比与转化率，可以简单地确定乳糖发酵活性。13C-葡萄糖示踪的癌细胞与组织研究中经常通过13C-丙氨酸和13C–谷氨酸的生成（由于与胞外胱氨酸的交换）指示丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性和对谷胱甘肽(半胱氨酸是其前体)的需求。13C原子由葡萄糖到胞内代谢物的命运同样可被追踪，以找到维持癌细胞增殖与生存的关键合成与分解代谢途径，如戊糖磷酸途径(PPP)、Kerbs循环、丝氨酸-甘氨酸-一碳代谢、谷胱甘肽合成、非必需氨基酸合成、嘌呤/嘧啶核苷酸生物合成、核苷酸糖(如UDP-N-乙酰葡糖胺)合成、糖原和脂质合成等。此外，通过合适的大分子水解方法可以确定蛋白质与RNA中新掺入的合成（标记的）非必需氨基酸或核苷酸。这种“生物大分子的代谢组学”尚处于起步阶段，而如何对于这些大的代谢产物精确检测和定量至关重要。
戊糖磷酸途径提供了为生物合成与抗氧化代谢所需的胞内NADPH、与核苷酸合成所需的核糖。因此，增殖中的癌细胞需要极强的戊糖磷酸途径代谢活性。然而我们并不清楚在癌细胞中，戊糖磷酸途径在多大程度上通过氧化阶段参与了NADPH的产生。借助特殊的13C同位素标记葡萄糖可区分氧化支与非氧化支代谢活性，如通过质谱分析[13C-1,2]-葡萄糖，通过核磁分析混合的[13C-1]-和[13C-2]-葡萄糖。
尽管乳酸发酵活性增强是肿瘤代谢的特征之一，肿瘤细胞内仍存在许多其他同等重要的适应性代谢变异。长期以来人们一直认为线粒体在癌症中不起作用。而13C-葡萄糖，13C-谷氨酰胺和13C-脂肪酸示踪实验显示，即使在低氧条件下，癌细胞通常也会在线粒体中氧化多种底物。许多癌细胞都需要大量谷氨酰胺。谷氨酰胺在转氨基反应中(核苷酸和UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成中)作为氮的供体。而谷氨酸作为氨基转移酶的共同底物，其重要来源之一也是谷氨酰胺。基于核磁与质谱的SIRM研究表明，无论是体内还是体外的人肺癌细胞模型中，线粒体代谢的各个方面(包括回补的丙酮酸羧化作用)均被激活。
线粒体代谢，磷酸戊糖途径、糖酵解共同为核苷酸的生物合成提供原料，为细胞增殖提供了基础支撑。13C-葡萄糖示踪实验显示，游离核苷酸的核糖亚基直接来自于葡萄糖（或糖原），而含氮碱基则有多种来源。尿嘧啶（及随后产生的胞嘧啶）主要来源于天冬氨酸。由于天冬氨酸胞外浓度非常低且不能有效转运，因此其主要在细胞与组织中从头合成。天冬氨酸可以在胞浆中GOT1酶或线粒体中GOT2酶的催化下由草酰乙酸与谷氨酸的转氨基反应合成。通过[U-13C,15N]-谷氨酰胺标记，高浓度的m+5天冬氨酸同位素异数体(即13C4,15N1)可证明转氨酶GOT1/2的激活。这种转氨基反应也是天冬氨酸/苹果酸穿梭系统的一部分，用于将还原当量由细胞质转移到线粒体，通过电子传递链进行氧化。在呼吸缺乏的情况下，丙酮酸可充当电子受体，并利用丙酮酸羧化酶来维持天冬氨酸合成。的确，通过对患者进行[13C6]-葡萄糖输注的SIRM分析显示，人肺癌细胞中丙酮酸羧化酶被激活。通过比较[13C6]-葡萄糖和[U-13C,15N]-谷氨酰胺，我们还发现谷氨酰胺比葡萄糖在癌细胞中更适合于天冬氨酸和尿嘧啶环的合成。有趣的是，在哺乳动物细胞中由于缺乏天冬酰胺酶，天冬酰胺并非天冬氨酸的前体，但是它可以在低谷氨酰胺利用率条件下挽救细胞的生长和存活。
一碳代谢在细胞周期调控过程中起关键作用，而甘氨酸是甲酰四氢叶酸(formylTHF)中一碳单元的来源，可提供两个额外的嘌呤环碳。嘌呤合成需要甘氨酸作为两个碳和一个氮的直接供体。在血清中甘氨酸可直接获取，而在细胞内甘氨酸由丝氨酸产生，而丝氨酸又是由糖酵解中间体3-磷酸甘油酸产生的。在某些人源癌细胞中该途径上调，多达8-9％的葡萄糖可能被调用进行丝氨酸合成。此外，嘌呤合成需要谷氨酰胺。通过[U-13C,15N]-谷氨酰胺标记，我们发现嘌呤核苷酸环中的三个氮原子来源于谷氨酰胺，其中两个氮来源于直接的转氨基反应，另一个来源于经由谷氨酰胺转化的谷氨酸的转氨基作用生成的天冬氨酸。除了作为核苷酸的生物合成原料，一碳代谢物(如5-甲基-THF)也是甲基的来源，参与S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)对S-腺苷甲硫氨酸(SAM) 的补充转化。SAM是许多甲基转移酶的通用甲基供体，参与了组蛋白及DNA中胞嘧啶的表观遗传甲基化。
尽管许多肿瘤是由于癌蛋白与抑癌蛋白的改变进而导致细胞代谢重编程产生的，但在某些情况下，酶活的直接丧失或功能获得成为致癌作用的关键。例如，延胡索酸水合酶(FH)与琥珀酸脱氢酶(SDH)活性丧失对多种侵袭性家族性肾癌的发展中起关键作用。这两种酶活丧失分别导致延胡索酸及琥珀酸的积累，由13C标记实验可以发现，延胡索酸及琥珀酸主要来原于谷氨酰胺(图5)。这两种酶活丧失的细胞通过发生大量的还原羧基化可逆转异柠檬酸脱氢酶(IDH)的作用，以支持肿瘤生长过程中的脂质合成。延胡索酸和琥珀酸的积累还可以有效地抑制依赖酮戊二酸的双加氧酶活性，包括脯氨酰羟化酶(如羟化低氧诱导因子Hif1α用以标志蛋白酶体降解)、表观遗传调节酶10-11易位蛋白(TET)以及含jumonji结构域的组蛋白K/R去甲基化酶等。
除酶活丧失外，功能获得性突变同样促进肿瘤发展。IDH1,IDH2是NADPH依赖的两种分别出现在胞浆与线粒体的同工酶，常在肿瘤内发生功能获得性突变。这种突变使IDH酶的活性，由原有的异柠檬酸氧化脱羧为酮戊二酸(α-KG)转化为将α-KG同NADPH还原为2-羟基戊二酸(2-HG)(图5)。目前认为，2-HG是典型的致癌代谢物，其在某些神经胶质瘤和急性髓细胞性白血病(AML)患者癌细胞中高水平累积。IDH的功能获得性突变一方面消耗NADPH、产生2-HG (抑制α-KG依赖的双加氧酶活性)；另一方面抑制组蛋白去甲基化，以阻止细胞分化。
NADPH是关键的辅酶，NADPH/NADP+在细胞中受严格调控，以维持生物合成及抗氧化防御。通过各种氘代底物标记、遗传学修饰代谢酶、NADPD定量等方法联用，可巧妙地追踪NADPH的来源与去路，如分辨细胞内生成的NADPH主要来源是戊糖磷酸途径还是IDH酶催化途径等。
5. 未来展望
多数情况下，人类癌症中的代谢重编程涉及定量(改变现有代谢产物的浓度)而非定性变化(如IDH等功能获得性突变形成新的代谢产物)。稳定同位素示踪为解决系统性代谢命运和细化至单原子的研究开辟了新途径，这些将有助于我们深入理解癌细胞增殖、存活和转移所需的重编程代谢网络。此外，同位素示踪数据在严格的高通量代谢分析中也是必不可少的，一方面它可以告知细胞、组织及人体内在给定代谢网络中单个酶和/或转运蛋白的动力学变化；另一方面，SIRM可与功能基因组等多组学数据联合阐明代谢调节网络，辅助临床诊断与治疗。
目前，绝大多数的稳定同位素标记研究中使用的是2D细胞培养模型，并不能很好地反应细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用。这些微环境因素对于细胞的行为与功能包括基因表达谱、耐药性等都至关重要。这也是美国国家癌症研究所放弃NCI-60细胞药物筛选计划的关键原因。3D细胞培养技术的发展，包括支架(如基质胶、水凝胶)和无支架(悬滴，微模型/U形细胞排斥表面型培养板)方法构建单种细胞成球、类器官等，规避了传统2D细胞培养的缺点。然而，这一方法也存在许多技术挑战，例如球体形成时间过长、效率可变和/或难以高通量处理。对于SIRM研究，胞外基质引入的额外支架如基质胶也会对代谢物定量造成一定程度的干扰。最近发展的借助磁的3D生物打印(M3DB)技术克服了这一困难，通过金-氧化铁-多聚-L-赖氨酸纳米颗粒磁化细胞并控制弱磁场，可以使细胞在6-384孔细胞排斥表面型培养板中组装成球或成类器官。
我们已经将这一方法应用于SIRM研究，将源自患者的类器官(PDO)培养在含[13C6]-葡萄糖的培养基的96孔板中，实验组添加抗肿瘤硒。如图6所示，[13C6]-葡萄糖转化为多种糖酵解、戊糖磷酸途径、Krebs循环、糖异生、嘌呤/嘧啶/谷胱甘肽生物合成途径的代谢产物，以及对肿瘤生长与发展重要的其他途径，如UDP-N-乙酰葡糖胺的合成等(未显示)。PDO在SeO3处理后的代谢变化不敏感，而2D细胞培养则不同，6.25 mM SeO3处理A549细胞系仅24小时后，其生长与代谢便发生大幅变化。通过这种方法，可以有效地对癌细胞类器官或类球体进行高通量SIRM研究。SIRM与不同细胞类型的3D培养和基于微流控技术结合的发展将有助于改变对已有的肿瘤微环境及癌细胞与基质细胞代谢的理解。
图6 源自患者的类器官(PDO)响应抗肿瘤硒的SIRM研究
另一种常见的临床前模型是对小鼠进行肿瘤异种移植，包括建立人源性肿瘤异种移植(PDTX)模型。目前已有通过大剂量静脉注射、连续输注稳定同位素示踪剂等方法在PDTX模型体内进行SIRM的研究，然而该方法仍有局限性。首先，注射示踪剂时麻醉剂、小型手术等在不同程度上对动物造成了应激伤害可引起代谢基线的改变；其次，大剂量静脉注射、连续输注稳定同位素示踪剂的方法需要数分钟至数小时不等。这限制了对某些快速变化通路，如糖酵解、戊糖磷酸途径、Krebs循环的监测，也限制了某些脂质、蛋白质、核苷酸的从头合成通路的长期监测。
最近，我们建立了一种通过液体饮食方法，可以稳定地引入同位素示踪剂。这种方法是非侵入性的，且对示踪时间没有上述严格的限制。用[13C6]-葡萄糖喂养小鼠18小时后，我们发现小鼠不同器官中蛋白的从头合成利用模式不同(图7)。通过这种非侵入喂食同位素示踪方法，我们还在PDTX小鼠模型中发现原发肿瘤及远端淋巴结转移的癌细胞二者间存在明显的葡萄糖代谢差异。未来，应用这种示踪剂递送方法可以极大地促进代谢网络分析，并在人源性肿瘤异种移植模型体内进行高通量SIRM研究。
图7 ECF-UHR-FTMS表征小鼠5种器官蛋白中[13C6]-葡萄糖插入的不同
为进一步提高一维核磁分辨率，以获得更多的结构信息分辨同位素异构体，多维核磁共振技术需要进一步发展，特别是在提升数据采集速度方面。该领域内已有一些许多技术上的改进：在方法学上，如非均匀采样、投影重建等；在硬件方面，如使用多个接收器同时对2个或更多个二维核磁数据采集。通过选择性激发方法，还可降低多维核磁所需的增量累加次数，适合于磷酸糖检测。在未来，以上几种方法的联用将成为高通量SIRM的多维核磁分析的重要发展方向。
能进行mSIRM研究的UHR-FTMS，其分辨率在m/z=400的同位素精确度下超过350,000 FWHM(R400)，最高甚至几百万，如Thermo的Orbitrap Fusion™Lumos™ R400最高达106，而Bruker的SolariX XR FTMS R400超过106。尽管UHR-FTMS具有极高的灵敏度、质量精度及分辨率，对复杂样品的同位素异数体混合体系鉴定仍具挑战。目前已有一些方法助于解决这些问题。例如，UHR-FTMS的UVPD(紫外光解离)技术可以活化目标物的共振基团诱导化合物解离，通过断裂脂酰基双键限制可引入稳定的同位素标记基团的位置，有助于脂质代谢产物的检测。UHR-FTMS目前正在积极改进纳米电喷雾、透射型实时直接分析(DART)、解析电喷雾离子化(DESI)等技术，以及一些新兴技术，如激光热解吸和“纸喷”技术。此外，通过日益庞大的稳定同位素标记分子库与不断改进的UHR-FTMS方法协同作用也使质谱定量更加精确，如使用氘代氨基酸标准品来定量粗提物中13C和/或15N标记的氨基酸等。
质谱的超高灵敏度也意味着未来技术上的发展趋势之一是对飞摩尔级的痕量代谢物有效的鉴定。一方面，可能存在含量极低但功能上极强的代谢产物；另一方面，当样品量很少时，我们便难以单次有效地检测出各种代谢产物。例如单细胞样品，其体积一般仅为1-2 pL(癌上皮细胞)，1μM浓度水平的代谢物总量约为1-2 amol，经色谱分离后电喷雾离子化后，最终检测效率仅占约1％，这意味着只有几千个离子到达检测器。
在确定了SIRM标记与检测方法后，最重要的问题便是如何严格重建代谢网络(包括跨细胞和组织的事件)。尽管有多个数据库和工具可用于路径映射，如KEGG、HMDB、Metacyc、Recon3D等，但基于稳定同位素标记数据的自动重建及原子路径解析仍具挑战性。目前已有的数据库中对于组织特异性代谢匹配方面往往不足，尚处研究开发阶段。
在原子水平上准确重建代谢网络是代谢流分析的基础，包括通量平衡分析(FBA)和动力学模型分析(KMA)。FBA方法基于反应的化学计量比和稳态假设，因此不需要代谢网络中酶/转运蛋白的具体动力学参数。FBA模型分析不能提供单独的酶/转运蛋白动力学信息，也不能预测由这些蛋白扰动所引起的代谢流变化。KMA方法则需要一套完整的酶/转运蛋白动力学参数来求解稳态或非稳态条件下的微分方程组，因此可以提供单独的酶/转运蛋白动力学，并且可以预测代谢网络如何响应蛋白质成分的变化。对这些方程组进行参数化需要消耗大量时间精确地建模，因此未来信息学的发展将着眼于此，通过缩小初始参数空间等方法，帮助非专业人员进行后续高通量动力学建模。
以上通路分析方法不仅有助于人们对于癌症或其他疾病中代谢重编程的定量理解，还在促进代谢重编程相关的基因和蛋白质组学结果中相互关联，展现出强大的系统整合功能。这种整合对于破译代谢网络调节以及最终反过来获得疾病诊治的新思路至关重要。
评论
尽管现代多维核磁-高分辨质谱联用技术及庞大的同位素标记分子库对SIRM研究提供有力的信息，然而对未分级复杂代谢物的准确鉴定仍面临挑战。本文通过实例详细论述了SIRM在肿瘤代谢领域的现状与前景，其中特别强调了未来3D培养模型与PDTX模型的使用，以及方法学上如何恰当引入同位素、化学衍生化、改进分析仪器及整合建模等，为读者学习SIRM相关的实验设计，以及如何重新认识肿瘤代谢重编程提供了有效的帮助。