科研| FOOD CHEM：基于GC / MS鉴别我国黄酒的挥发性有机化合物和年份（国人佳作）
编译：思越，编辑：谢衣、江舜尧。
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年份是评估黄酒质量的重要标准，陈酿时间和香气之间存在密切的关系，并与挥发性有机化合物（VOC），糖和氨基酸等物质有关。“Wine-Omics”的概念于2008年提出，通过使用核磁共振（NMR）和气相色谱/质谱（GC / MS）对酒的代谢数据提出新的分析思路。对于黄酒的陈酿和年份差异，作者通过XCMS-Online软件结合偏最小二乘回归（PLSR），基于GC / MS的代谢组学以识别VOC。偏最小二乘回归可以识别七个不同陈年的黄酒样本。从所有优化的候选峰中分离出总共104个特征组，初步鉴定出94种挥发性有机化合物作为陈酿标记。其中，醇类，硫化物，酚类及其衍生物，小酯类和酸类更容易识别年份较短的黄酒，呋喃，芳烃，醛，酮，大多数酯和酸更容易识别年份较长的黄酒。同时，还提出了某些挥发性有机化合物的潜在来源，以供进一步研究。
论文ID
原名：Age-dependentcharacterization of volatile organic compounds and age discrimination in Chineserice wine using an untargeted GC/MS-based metabolomic approach
译名：基于GC / MS的非靶向代谢组学方法对黄酒的挥发性有机化合物和年份进行鉴别
期刊：FoodChemistry
IF：5.399
发表时间：2020年4月23日
通讯作者：周哲敏
作者单位：江南大学
实验设计
样本选择来自浙江某公司的34个黄酒样品，分别来自0Y，1Y，2Y，3Y，5Y，10Y和15Y七个不同陈年，每年3至6批。使用顶空固相微萃取（HS-SPME），固相萃取(SPE)和气相色谱-质谱联用仪(GC / MS)的结合分析。所得数据导入XCMS-Online软件中进行特征检测和校正，将特征与年份建立XY变量坐标系，使用UNSCRAMBLER 9.7软件进行PLSR分析，并通过通过计算PLSR-VIP的95％置信区间选择优化的候选特征，使用XCMS-Oline软件将METLIN标准数据库匹配假定代谢特征建立为特征与成分矩阵，并通过与NIST 05 和98 MS数据库及现有研究的鉴定物进行比对验证。
实验结果
1.使用XCMS-Online软件进行数据预处理和候选特征提取
首先使用XCMS-Online软件对来自七个不同年份黄酒的原始GC / MS数据进行了预处理。图1是以保留时间偏差为例通过由几个迭代步骤确定。为了使该校正程序可视化并进行质量控制，将Rt校正前(图1a) 后 (图1b) 采集的所有总离子色谱图的叠加图以及Rt校正曲线(图1c)进行显示。为了确保预处理方法的有效性，将IS的原始特征（2-O，CAS123-96-6，M / Z 45/55）作为验证指标与预处理后的特征进行了比较。基于以上预处理，从原始SPME-GC和MS-GC / MS数据分别得到513个特征和773个特征，并从中进一步分析了392个和637个具有统计意义（p≤0.05*）的特征。但这些特征由于其Rts、峰形等特征差异而无法被很好的分类，因此需要对特征进一步优化。
图1 34个样品使用HS-SPME、SPE、GC/MS预处理前（original）和预处理后（corrected）的结果。SPME-GC / MS（左）、SPE-GC / MS（右）
2.PLSR优化候选特征和年龄区分
使用PLSR对上述特征进行优化。相比于优化前(47%+16%和50%+10%)，变量协方差矩阵PC1和PC2的PLSR得分略微上升(51% + 18%和57% + 16%)（图2，图3），并在优化后的载荷图中，特征峰的数量分别减少到157和164个。对于SPME-GC /MS的特征，在优化之前，将七个不同的年份分为0、1-2、3-5、10和15年五个时间段，PLSR处理后，分为0, 1–2, 3, 5, 10和15六个时间段。对于SPE-GC/MS的特征，优化之后，七个不同的年份被明显分开（图3）。在优化后的载荷图中观察到的筛选后变量，可能代表了模型中不同年份黄酒化学差异的代谢物（图2b和3b），并基于载荷图中PC1的值，将总体趋势分为0-3和5-15年两个组。
如图2b和3b所示，通过优化的SPME-和SPE-GC / MS数据得出的PLSR模型在所有年龄段均具有0.979199和0.984345（Q2）的准确性，说明PLSR可对0-15年中近98%的样品准确分类，并显示出良好的R2值，说明PLSR模型对黄酒的年份区分是可行的，并将优化的157个和164个特征提取进行后续处理。
图2 对392个显著峰（p≤0.05*）进行偏最小二乘回归（PLSR）分析。中图为载荷图。左列为优化前的392个峰，右列为优化后的157个峰。
图3 对637个显著峰（p≤0.05*）进行偏最小二乘回归（PLSR）分析。中图为载荷图。左列为优化前的637个峰，右列为优化后的164个峰。
3.确定最佳候选特征作为年份预测标志
上述157个和164个特征，为了进一步预测候选代谢物以及其在识别年份中的特征，通过与NIST 05 和98 MS数据库及现有研究的鉴定物进行比对验证，识别出对年份影响较大的关键代谢产物。来自原始GC / MS数据的代谢物MS特征被鉴定为已知和未知的，并且根据Rt，变化趋势和峰形将这157个和164个特征分为50个和54个特征组（表1，表2）。例如，在Rt为10.52分钟，222、245、276、324的m / z为50、41、42和43的4个特征，被认为是由相同化合物形成（表1）。因此，这4个特征被分到相同的特征组。最终，一共鉴定出104个特征组，共94个挥发性有机化合物（VOC）被初步确定为年份标记。在这94种经鉴定的VOC中（表1，表2），已知的化合物包括醇，硫化物，乙酯，酸，酚及其衍生物，呋喃，芳烃，吡嗪，内酯，醛和酮等。
表1 对SPME-GC/MS数据优化后得到的157个候选特征的初步鉴定
表2 对GC/MS数据优化后得到的164个候选特征的初步鉴定
4.黄酒中VOC和年份的依赖性特征关系
根据上述分离的104个特征组和94个挥发性有机化合物（VOC），进一步总结其与黄酒0-15年份的统计关系（表3）。总体来说，在0年的黄酒中，所有显著的VOCs均呈现出总体下降的趋势，而这些VOC在10年和15年样品中呈现出总体上升趋势，但在1-5年样本中的趋势不稳定，与之前常规多元统计分析的结果一致，即醇，硫化物，酚及其衍生物，部分乙酯和酸在0-3年样品中显著下调，呋喃，芳烃，大多数乙酯和酸，醛和酮在10年和15年样品中显著上调。呋喃，3-甲基硫代丙醇，3-甲基丁醇，3-甲基丁酸乙酯，辛酸乙酯，苯乙酮，2-苯基丁-2-烯醛，2-苯基乙酸乙酯和3-甲基丁酸对于年份的鉴别更有意义。
0年/未封存的黄酒，甲基丁醇，2-甲基丙醇和3-甲基丁醇被显著区分，这也提示了0年黄酒中具有典型的“指甲油或溶剂”的香气特征。这可能是由于酵母的代谢活性引起的，当酵母通过Ehrlich途径合成氨基酸时，会产生如杂醇的副产物。3-甲基硫代丙醇、3-甲基硫代丙醛在啤酒陈酿过程中，被证明是DMTS合成的有效前体，有助于“焦糖状”的香气和强度增加。作者在0年黄酒中检测到了3-甲硫基丙醇，并且DMTS随着年份的增加呈现上升趋势，所以黄酒中3-甲硫基丙醇的含量也会随着年份增加而下降，并可能具有与啤酒相同的效用。同时，还发现肉桂酸乙酯随着年份增加而上升，且3-丙酸乙酯呈现下降趋势，说明肉桂酸乙酯可能在陈酿过程中是由3-丙酸乙酯分解得到的。棕榈酸乙酯，油酸乙酯和没食子酸乙酯在该样品中也被很好区分，并和威士忌及日本泡盛类似具有随着陈酿时间的下降趋势。在陈酿过程中，还发现源于水稻和小麦的2-戊基呋喃和γ-壬内酯的下降。
1年黄酒。1年是陈酿的早期，由于醇进一步氧化为醛和酸，酯化，其典型的“指甲油或溶剂”香气特征下降，而乙酰丁香酮和4-乙基苯酚显着增加赋予1年黄酒“丁香和烟熏”的香气。TMP和4-甲基苯酚也在0年和1年样品中被识别，4-甲基苯酚是微生物发酵过程中产生，在泸州老窖中赋予其“泥土”样气味；四甲基吡嗪（TMP）源于微生物代谢和美拉德反应。
2-5年黄酒。2-5年阶段被认为正经历陈酿期。此阶段鉴定出的大部分VOC成分都是未知的，2-苯乙醇和2-苯基乙酸乙酯被鉴定并赋予“花香甜味”香气，具有“月桂油”香气的十二烷酸可以区分2年和5年的黄酒，“淡酱油”香气的（6-甲基吡嗪-2-基）甲醇、苯酚和愈创木酚分别在3年和2年样本中与其他年份的变化趋势相左。
10-15年黄酒。10-15年阶段是陈酿的后期。糠醛，5-甲基糠醛和5-羟甲基糠醛等典型的“焦糖状”香气的呋喃被鉴定，呋喃源于碳水化合物脱水并通过美拉德反应，并产生陈酿中褐色，而“焦糖状”香气是未储存和陈酿酒之间最显着的香气之一。在此阶段还鉴定出2-苯乙醇，苯甲酸乙酯，2-苯乙酸乙酯，苯甲醇，2-羟基苯甲醛，4-羟基苯甲醛，苯乙酮和丁苯酮等以“玫瑰花香蜂蜜甜味”芳香剂。同时，醛和酮是在陈酿过程中首次产生的，且还发现具有“奶酪样酸味”的2-甲基丙酸，3-甲基丁酸，庚酸，苯甲酸和4-乙氧基苯基乙酸。此外，还鉴定出了土臭素在该阶段样本中的显著。土臭味素赋予大多数酒精饮料“泥土味”，由几种不同的微生物产生，前人研究发现在小麦曲、大曲中也检测到该物质。在10-15年黄酒样本中，VOC的数量和种类的增加表明，随着年龄的增长，香气的强度和种类会变得更多元。
表3 94种挥发性有机化合物（VOC）或年份标记与不同年份样本的统计关系
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原文网址：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814620307627