蛛网膜下腔出血后迟发性脑缺血:实验与临床的脱节和临床对研究的大量需求
陈彩霞 胡成欢 翻译 马新华 校对
摘要
背景：迟发性脑缺血(DCI)是动脉瘤性蛛网膜下腔出血(SAH)后最严重的并发症之一。尽管人们在神经危重症治疗上取得了进展，但DCI仍然是导致患者发病率和死亡率、住重症监护病房和住院时间延长以及医疗费用高昂的重要原因。大动脉血管痉挛通常被认为是导致DCI的原因。然而，最近减轻血管痉挛以改善患者预后的临床试验失败，提示大动脉血管痉挛和DCI之间并没有相关性。因此，人们的兴趣转向了其他潜在的机制，如微血管功能障碍和弥漫性去极化。动物模型可用于病理生理学研究，但临床相关性可能难以建立。
方法：本文中，我们对SAH动物模型的文献进行了系统的回顾，特别是DCI和神经功能缺损。
结果：我们发现狗、兔和啮齿动物模型并不全都出现DCI，尽管一定程度的血管功能障碍是常见的。灵长类动物模型可靠地再现了延迟性神经缺陷和缺血性脑损伤;然而，伦理问题和成本限制了它们的转化效用。
结论：为了便于向临床转化，目前迫切需要重现SAH后DCI的病理生理和基本特征的临床相关动物模型。
关键词：蛛网膜下腔出血，迟发性脑缺血，动物模型
引文
迟发性脑缺血(DCI)是动脉瘤性蛛网膜下腔出血(SAH)最严重的并发症之一。它发生在大约20%的动脉瘤破裂的幸存者中，是SAH后继发死亡、功能不良结局、延长住重症监护病房(ICU)和住院时间的主要原因。钙通道阻滞剂尼莫地平是美国食品和药物管理局(FDA)批准的唯一用于预防DCI的药物。在日本， Rho相关的含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)抑制剂法舒地尔也被用作预防DCI的标准方案。然而，所有其他的实验性疗法在随机对照试验中都失败了，包括内皮素受体拮抗剂克拉生坦，它能有效逆转人体血管痉挛，但未能改善患者总体临床结果。尽管临床试验设计和有缺陷的临床前研究可能在临床前研究结果的临床转化失败中发挥了一些作用，但更有可能的是，人们的注意力被错误地导向了减少大动脉血管痉挛，而不是关注其他潜在的DCI的原因，如微血管功能障碍、炎症、血栓栓塞和弥散性去极化。实验性SAH有许多模型，但目前仍不清楚在每个模型中能在多大程度上实现DCI。这一直是病理生理学研究和治疗试验的限制因素。本文中，我们回顾了现有的SAH动物模型及其发展成为DCI的倾向，用以探索其病理生理学和寻找临床相关的实验模型。
方法
我们使用关键词“蛛网膜下腔出血”、“迟发性脑缺血”和[“动物”或“实验”]进行了包括2017年11月在内的PubMed搜索。我们排除了临床研究和综述文章、非英文的文章、仅评估颅外血管系统的研究，以及使用溶血或非全血血液制品的研究。我们还排除了一项只使用转基因动物模型而没有野生型对照的研究，一项没有评估任何与DCI相关的迟发性终点的研究，一项人工诱导弥散去极化的研究，以及一项诱导SAH后诱发局灶性缺血的研究。总的来说，我们的DCI集中搜索策略检测到了具有代表性的实验性SAH的文献。我们只记录了没有采用任何生理、药理学或遗传干预的对照组的SAH结果。我们将DCI定义为在SAH后最初的全脑缺血恢复后，随着时间的推移，脑组织灌注的恶化。迟发性神经功能缺损(DND)是指在一段明显的稳定或改善时期后，发生的感觉、运动或认知能力的恶化。如果使用组织学标志物如Fluoro-Jade染色或TdT介导的dUTP缺口末端标记证实细胞死亡，或组织学上证实细胞计数减少，则可发现组织损伤。采用组织学检查，或通过计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)记录Frank梗死。我们采用一般的线性随机截距混合效应模型构建了以动脉直径测量的血管痉挛的多变量线性预测模型，该模型包括物种、SAH诱导方法、血管测量时间、测量的动脉、测量方法。
结果
SAH实验模型的总体特征
我们通过最初的搜索策略确定了324项研究。在应用上述排除标准后，我们对119项研究进行了分析，其中对121个实验队列进行了描述(表1)。这些研究共采用了7个物种，最常见的是大鼠(32%)和狗(22%)，其次是小鼠(17%)、灵长类动物(16%)、兔子(12%)、猫(1%)和猪(1%)。在其中两项研究中，研究者使用了两种不同的物种(狗和灵长类动物，以及老鼠和兔子)。SAH诱导方法包括交叉前池、枕大池或蛛网膜下腔注射血液(61%)，颈内动脉终末段血管内穿孔或基底动脉外穿孔(24%)，在颅内动脉周围直接放置血块(14%)，或蛛网膜下腔静脉横断(1%)。血液注射被用于所有物种，血管内穿孔仅用于啮齿类动物，动脉周围血凝块放置仅用于犬和灵长类动物。部分模型进行了枕大池重复血液注射2-3次(其中大鼠的研究中9项进行了单次注射，7项双次注射;家兔研究中11项单次注射、3项双次注射;狗的研究中25项双次注射、1项3次注射)。大动脉血管痉挛是最常采用的研究终点(57%)，特别是在大型动物中。相比之下，只有一小部分研究(8%)对微血管异常进行了评估，主要是小鼠研究，而且是最近的研究。在所有研究中，DND的评估不到一半，组织学结果不到四分之一。在大多数研究中，终末评估仅限于第一周，尽管有些研究持续长达48天。
表1 实验性SAH研究队列的总体特征
大动脉痉挛
我们搜索到,大动脉痉挛经常被报道在灵长类动物的研究(37%的队列研究)中,其次是狗(25%)、大鼠(19%),兔子(9%)和小鼠(8%)(表2)。最常见的SAH建模方法中使大动脉痉挛的方法是枕大池注射(46%)、血管周围血凝块(35%)和血管内穿刺(11%)。研究检查了基底动脉(52%)、大脑中动脉(19%)、大脑前动脉(11%)和颈内动脉(10%)的血管痉挛。尽管大多数队列中出现了血管痉挛，血管痉挛通常程度轻微，对应于合并数据集中对照血管直径的中位数为70%(58-86%四分位数范围)(即仅减少30%)。一般线性随机截距混合效应模型显示，物种[F (4,109)=7.00;p<0.0001]， SAH诱导方法[F (3, 109)=3.28;p=0.0237]， SAH后时间[F (2, 109)=6.71;p=0.0018]，动脉受累[F (4, 109)=10.77;p<0.0001]，血管痉挛评估方法[F (3, 109)=2.77;P =0.0449]是血管痉挛程度的独立预测因素。事后分析表明，狗的血管痉挛最严重，随后依次是小鼠、兔子和大鼠，灵长类动物的血管痉挛最轻。枕大池血液注射和血管周围放置血凝块导致的大动脉血管痉挛最严重，其次是血管内穿刺和交叉前血液注射。大脑中动脉的血管痉挛较严重，颈内动脉和大脑前动脉次之，基底动脉和大脑后动脉血管痉挛较轻。虽然少数研究在SAH后的多个时间点没有显示出明显的血管痉挛的时间进展，但在所有研究的汇总数据集中，SAH后4-7天测量的血管痉挛比1-3天和8-21天更严重。数据还表明，虽然在大多数病例中可检测到一定程度的大动脉血管痉挛，但即使在最严重的病例中，它也显得过于轻微，无法导致DCI、DND和梗死。
表2 检测SAH后大动脉痉挛的队列
微血管异常
鉴于大动脉痉挛和临床结果不相符合,近年来研究者们的关注转向可能影响组织灌注和导致DCI和DND的微血管异常 (表3)。所有的队列研究中均采用软膜或脑实质的微血管异常作为研究终点,小鼠研究中最常用,狗和大鼠也常用。常规组织学和免疫组织化学检查均发现微血栓累及大脑皮层、海马和小脑实质小动脉。然而，在一些研究中，由于缺乏与假手术对照组的定量比较，因此很难评估这一发现的显著性。在唯一一项进行了时间进程研究的文章中，小鼠在SAH后2天达到微血栓的高峰。在电子显微镜、光学微血管造影和双光子显微镜下都可以观察到软脑膜和脑实质小动脉甚至毛细血管的缩小。直径越小的血管受影响越严重。在活体动物研究中使用双光子显微镜检查时，血管收缩的程度足以导致灌注减少。研究也发现了炎症的证据(例如，P选择素增加)。这些微血管异常都预示脑血管阻力的显著增加，并足以引起组织缺血，特别是同时伴有轻微或中度的大动脉痉挛时。然而，在大多数情况下，这些变化出现在SAH后第一次检查的时间点，并没有随着时间的推移而加重。因此，它们是否与DCI的发展相关尚不清楚。
表3 检测SAH后微血管异常的队列
灌注异常
在我们的搜索范围内共有17项研究进行了脑血流量(CBF)的检测。表4总结了SAH模型的物种、SAH的造模方法、SAH后灌注评估的时机和技术。不论选用哪种脑血流(CBF)测量技术，尽管所有研究中约有一半显示灌注异常，但低灌注仅为中度(约为基线的40-80%)。此外，只有大约一半的研究在SAH后采用了多个评估时间点。在这些研究中，只有3个研究发现灌注恶化(即DCI)。一项对犬的研究发现，使用微球技术枕大池血液注射后，与第1天相比，第8天时大脑、小脑和脑干血流量显著降低(CBF基线的60-70%)。有趣的是，在这项研究中，大动脉痉挛与CBF无关。在最近的一项研究中，在小鼠颅内颈动脉血管内穿刺后，使用光学相关断层扫描检查，小鼠在第3天的灌注情况比第1天差。然而，灌注不足只是轻微的(CBF为对照组的83%)。最后，在大鼠视交叉前血液注射模型中，与SAH后1小时相比，低灌注在第2天显著恶化(CBF为对照组的40%)。总之，数据表明，无论采用何种造模方法和物种，大多数SAH动物模型都不能真实地再现严重到足以导致梗死的DCI。
表4 检测SAH后血流的队列
迟发性神经功能缺损
只有约20%的研究中使用基于意识、运动机能和或食欲的定性分级系统或定量评分进行了DND 检测(表5)。在小鼠研究(0/9队列)和犬类研究(0/8队列)未检测到DND，大鼠研究(1/16队列) 和兔子研究(1/5队列)中DND也非常罕见。DND的症状在灵长类动物中更常见(在7/13队列中检测到)，尽管在每个队列中只有一小部分动物出现(总共83只动物中的10只)。然而，发生DND的动物比例与人类中动脉瘤性SAH后发生DND的比率相似，这些动物中的大多数确实发生了缺血性梗死，在影像学或组织病理学上都得到了证实。DND在灵长类动物中最常见的症状是在SAH后3至8天观察到偏瘫或警觉性水平下降。不幸的是，除了一项灵长类研究外，所有的研究都使用了血管周围血凝块放置，无法得出不同SAH模型的DND倾向性的结论。这些数据表明，除了灵长类动物，动物模型并不能再现人类动脉瘤性SAH中观察到的DND。
表5检测实验性SAH后迟发性神经功能缺损的队列
组织损伤
18个队列中的15个队列进行了散在细胞死亡的检测评估,主要是在小鼠枕大池或交叉前血液注射后,以及大鼠血管内穿刺后(表6)。少数关于不同的物种和SAH模型的散在细胞死亡倾向性的研究未得出任何结论。皮质和海马体是最常见的受累部位。然而，迟发性损伤的证据很少。在血管内穿刺小鼠模型中，海马神经元计数减少比第1天检测到的细胞死亡(fluoro-Jade)更严重。在大鼠枕大池血液注射模型中，第5天时海马和皮层的神经元计数明显低于第3天。两项研究均可检测到大动脉血管痉挛(大脑中动脉直径减少50%)和DND。其他研究仅检测了单个时间点或没有对DCI引起的迟发性细胞死亡和SAH诱导方法引起的急性细胞死亡如高颅内压引起的全脑性缺血，或血管内穿刺引起的直接局灶性缺血进行区分比较。的确，在血管内穿刺研究中，细胞死亡通常是同侧的。
表6检测实验性SAH后散在细胞死亡的队列
比起散在细胞死亡(27项研究)，研究者们更常使用Frank梗死评估，在所有队列中有一半的研究采用，通常使用神经成像的方法。最常见的是灵长类动物血管周围凝块放置模型，其次是小鼠啮齿动物穿刺模型(表7)。有少量的研究依然未得出关于不同物种和SAH模型导致Frank梗死倾向的任何结论。与DND一样，脑梗死在灵长类动物中更常见(75%)，大多数病例表现出SAH手术同侧皮质受影响，并且与该动物的DND有关。然而，仍然缺少连续成像显示的迟发性梗死的直接证据。来自一个实验室的4个小鼠研究和来自另一个实验室的2个大鼠研究采用连续的核磁共振成像报告了SAH后2-3天的梗死。所有六项研究均采用血管内穿刺模型，并将DCI定义为在早期成像时不存在或面积较小，而后出现的的新发梗死灶。然而，这一定义并不能排除梗死在最初数小时发生或亚急性加重的可能性。此外，研究没有对梗塞的分布进行描述，梗死可能存在于穿刺动脉的范围内。因此，这些数据并没有提供确凿的证据证明梗塞是由SAH后的DCI引起的，而不是血管内穿刺过程本身破坏了动脉的结构完整性所导致的。
表7实验性SAH后发生显著梗死的队列特征
死亡率
按我们的策略搜索到的所有研究中，近80%的研究进行了死亡率的报道，在所有物种和SAH造模方法中，死亡率介于0到67%之间。在啮齿动物中和血管内穿孔方法后，死亡率通常较高，可能反映了与手术直接相关的无意识的死亡率。
讨论
本综述表明，动物模型，除了灵长类动物，不能完全概括动脉瘤性SAH患者的进展和结局。其原因与大多数动物模型中大动脉血管痉挛、微血管和灌注异常过于轻微有关，也与缺乏迟发性脑缺血、神经功能缺损和梗死有关。而迟发性脑缺血、神经功能缺损和梗死是SAH幸存患者中最严重的亚急性后果之一，与发病时出现的全脑或局部缺血性损伤相比，由于治疗时间窗的延迟，这些迟发性损害应该最易于治疗。因此，通过优化物种选择、SAH诱导方法、实验设计和临床相关解读，开发新的SAH动物模型，或在现有模型基础上进行改进，仍是亟待解决的问题。
动物模型中SAH后DCI的研究失败部分源于物种差异。人脑的大小和形态、白质含量、血管解剖和生理都与其他物种不同。值得注意的是，不同物种对蛛网膜下腔血液的清除率不同，而枕大池血液注射和交叉前血液注射后的啮齿动物清除速率较快。事实上，较快的蛛网膜下腔血液清除率是在许多大鼠和狗的SAH模型中进行两次注射的原因。此外，动物脑内丰富的侧枝血管可代偿任何区域性血管功能障碍。因此，在人类病理生理中可能比较重要的其他迟发性过程，如皮层弥散性去极化、微血栓形成和微栓塞可能不会发生在实验动物中或产生相同的影响。或者，在没有对同一动物进行纵向检查的研究中，DCI和DND可能被遗漏了，或者由于报告的偏倚可能导致没有DND或DCI的实验研究代表性不足。因此，在实验性SAH中DND和DCI的真实发生率很难从文献中得出。
非人类灵长类动物模型在蛛网膜下腔出血研究中具有吸引力，因为灵长类动物在系统性发育、解剖和形态上与人类相似，且其具有相对完善的行为学结果。在大多数灵长类动物研究中，SAH是由血管周围血凝块放置诱发的，这可能导致蛛网膜下腔持续存在血液及其分解产物，这对DCI至关重要。然而，血管周围血凝块的放置并不能重现颅内压(ICP)的急剧增加和动脉瘤破裂时短暂的全脑性缺血，和脑组织的急性暴露于新鲜动脉血液，这两种情况都可能导致人类的DCI。虽然DND和DCI在灵长类动物中比其他被研究物种更常见，但伦理问题、成本和低产出量使非人类灵长类动物研究受到限制，除非在少数专门机构中进行。因此，采用非人类灵长类作为SAH研究的主要物种是不现实的，但其仍有可能成为临床试验的门路。然而，我们应该承认，没有证据支持非人类灵长类动物的治疗效果比系统性发育较低的物种对人类的治疗效果更具预测性，无论这听起来多么直观。
SAH的实验模型众多，和大多数其他疾病模型一样，包括整体性及机械性(即还原)模型。整体性模型试图还原人类动脉瘤性蛛网膜下腔出血的所有特征，目的是，例如，检查治疗试验的临床相关结果。另一方面，模拟人类SAH一个特定的方面，以更好地理解其病理生理学机制。显然，现有的蛛网膜下腔出血模型没有一个能真正全面地再现人类动脉瘤性蛛网膜下腔出血。血管内穿刺模型实用性强，可迅速将含氧动脉血液注入蛛网膜下腔，提高颅内压。然而，它也与较高的急性局灶性脑缺血和梗死发生率有关，因为血管内细丝破坏了动脉的连续性，也有可能是由于在细丝插入时，导致的颈动脉延伸节段的大量内皮损伤。如果在血管内穿刺模型中没有使用敏感技术检查急性组织损伤(例如，在手术后24小时内进行MRI检查)，随后检测到的任何缺血性损伤都可能被错误地归因于DCI。如上所述，在灵长类动物中，血管周围血凝块的放置确保了血液及其分解产物在较长时间内以一定浓度存在，但该模型不能重现脑组织对于新鲜动脉血液的暴露或发病时的颅内压峰值。相反，直接行交叉前或枕大池血液注射模型再现了脑组织对于含氧动脉血的暴露和颅内压峰值，但注射的血液往往很快被清除，不能重现在很长一段时间内的血液及其分解产物的一定浓度的存在。由于这些过程与DCI和DND有关，血管周围血凝块放置和直接蛛网膜下腔血液注射模型仍然是机械性的，而不是整体性的。在啮齿类动物中进行DCI和DND研究的一个整体性模型是弹性酶-高血压模型。高血压背景下蛛网膜下腔弹性酶注射可诱发动脉瘤，其机制包括炎症和局灶性血管壁功能减弱，这些机制也与人动脉瘤的形成有关。该模型逼真地再现了自发性动脉瘤破裂和SAH的自然严重程度，模拟了人类动脉瘤性SAH。
然而，在机制上，自发动脉瘤破裂的时间不可预测性(5-14天)造成了DCI和DND时间的不确定性，弹性酶引起的动脉形态的改变，在理论上可能影响DCI和DND的血管机制。尽管有这些需要注意的地方，我们仍相信弹性蛋白酶-高血压模型对于自发性动脉瘤破裂后SAH的治疗干预对临床结果的影响的研究是有价值的，在该模型中自发性动脉瘤破裂以急性神经系统功能恶化为标志。因此，我们认为临床前干预措施的疗效筛查将受益于这种整体性SAH模型。
结果终点也可以更整体或更机械性。由于大多数物种的神经认知功能测试的敏感性较差，在实验性SAH后，将DND作为临床相关(即功能性)结果衡量的整体性方法并不容易。此外，与局灶性缺血模型不同，SAH模型中缺血的严重程度和分布即使在单一模型和物种内也可能有很大的变化。因此，每个SAH模型的组织学和神经认知功能结果还没有很好地被定义，如上所述，大多数研究确实未能使用现有的测试方法来检测DND。对于DND的定义也可能存在差异。此外，SAH诱导方法直接引起的即时或早期功能缺陷可能严重到足以掩盖随后的DND。更机械的参数解读更容易被定义。意识到大动脉痉挛并不是DCI或DND的良好预测因子,并且对于大动脉痉挛的有效治疗并没有改善临床结果后,研究者将对主要终点的关注点从大动脉痉挛转向微血管功能障碍、炎症、血栓栓塞和弥散性去极化。然而，这些更机械性的研究终点尚未被证明是DCI和DND的关键因素或预测因素。因此，需要更多的研究来建立因果关系。
纵向结果评估(最好是在同一动物中)对于确定是否有迟发性缺血或神经认知功能缺陷从而导致DCI和DND至关重要。不幸的是，仅有少数研究DCI和DND的实验性SAH研究采用了这一重要的研究设计原则，如上文所述。此外，研究不同终点(如脑血流、脑梗死、神经认知功能缺陷)之间的时空对应关系是建立因果关系的重要手段。除了一部分研究，这一点也被忽略了。在同一动物中进行纵向评估，并建立各种参数之间的相关性，最好使用先进的神经成像技术来测量大脑血液供需的失衡和损伤。最后，值得注意的是，在确定临床试验中研究性治疗方法的优先次序时，我们必须考虑临床前模型的局限性，也许更重要的是临床前数据的有效性，例如适当的实验设计和稳定的可重复性。
虽然开发临床前SAH模型的新型治疗干预的指南需要成立专家协会,我们仍可以借此文提供一些我们认为可以提高DCI或DND研究的可重复性和一致性，以及它们向临床转化的预测价值的至关重要的因素。最重要的是，DCI必须区分于与急性缺血，而DND必须区分于SAH诱导时直接引起的急性功能缺陷。这需要对同一实验动物进行纵向检查，最好持续7天以上。理想情况下，神经影像学可用于量化SAH诱导前24小时内的损伤和CBF，作为后续变化的参考点。当然，可用性和高成本是常规化使用这些工具的重要障碍。应在SAH诱导的前24小时内进行神经系统检查以检测急性功能缺陷，并且进行系统性检查得出功能缺陷随时间恶化的证据。重要的是，发病时的严重功能缺陷可能会掩盖后续的DND。例如，某些已知的模型可导致并发大血管缺血性中风，如血管内穿孔，在参数解读时应格外谨慎。感觉运动测试可在急性至亚急性期进行。然而，认知测试(如学习和记忆)常易与急性系统性障碍和感觉运动缺陷混淆，因此适用于后期阶段。原则上，治疗性干预应以分层的方式在一个以上的物种中进行试验。出于实际原因，可以从较小的、高实验产出的物种(如啮齿动物)开始，若能得出有希望的实验结果，可以逐步升级到较大的、最好是多脑回型物种(如猪)。同样，干预措施应在多个实验模型中进行测试。所有模型都有优点和缺点，除了计算方法，没有任何一个模型比其他模型更具有预测性。在选择模型时，必须记住它们的优点和注意事项，以及模型参数解读与目标机制的相关性。虽然在高实验产出量模型中进行初步筛选可能是合理的，但我们主张采用多种模型来提供组织学和神经学结果的信息。每只动物的生理学(如脑血流)、神经学(如感觉运动或认知功能缺陷)和组织学(如神经成像或组织学)参数应尽可能多地收集且在所有实验动物中保持一致。此外，严谨性和可重复性是必不可少的。实验应遵循良好的实验室操作原则，包括随机化和盲法、预先确定的排除标准(或采用意向治疗)、主要和次要终点和样本量，以获得足够的统计学力度。我们建议在初始队列中纳入相同数量的雄性和雌性动物，但以性别作为独立变量的小样本研究的统计学力度不稳定。如果在初始队列结果中观察到性别差异的趋势，则可以增加性别比较的样本量。尽管雌性动物的发情周期阶段具有科学性和生物学意义，但它不是临床转化的相关参数，所以临床试验不应包括或将雌性动物发情周期作为阶段分层事件。
总之，每一种SAH动物模型都有较多局限性，这使得将临床前的研究发现转化为有效的治疗措施变得困难。我们还了解到，机械性参数如血管痉挛不能直接代替临床相关参数，如组织学和功能性结果。为了提高DCI和DND研究的临床相关性和预测价值，我们应该投入更多的时间和精力开发更好的实验模型，而不是继续照搬以前研究中采用的模型。我们必须更加明确多种物种中现有模型的特征，并在实验中开发出一个可以代表动脉瘤性蛛网膜下腔出血不同方面的模型。最后，我们必须坚持良好的研究设计和报告原则，以保证我们研究的成果。
中南大学湘雅医院
重症医学科