以毛玻璃样结节为特征的肺腺癌单细胞转录组图谱
文章信息
文献标题：Single-cell transcriptome atlas of lung adenocarcinoma featured with ground glass nodules
发表时间：2020.10.06
发表杂志：Cell Discovery（IF=6.255）
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41421-020-00200-x
摘要
作为肺腺癌（adenocarcinoma, ADC）早期类型的一种，毛玻璃样结节（ground glass nodule, GGN）被越来越多地发现，目前占肺癌门诊患者的大多数。GGN 预后良好，其特点与实体腺癌（solid adenocarcinoma, SADC）有很大不同。为了更全面地理解GGNs，我们利用单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）比较了 GGN-ADC和SADC。我们分别将 5 例来自肺 GGN-ADCs 和 5 例来自 SADCs 术后的肿瘤样本消化成单细胞悬液，并用 10x Genomics scRNA-seq 进行分析。我们获得了 60,459 个细胞，并将其分为 8 种细胞类型，包括癌细胞、内皮细胞、成纤维细胞、T 细胞、B 细胞、自然杀伤细胞（NK）、肥大细胞和髓样细胞。该图谱全面刻画了肿瘤细胞和基质细胞。作者发现，在 GGN-ADC 癌细胞中与增殖相关的信号通路出现下调，而基质细胞中血管生成相关通路被下调，某些胶原蛋白基因在成纤维细胞中低表达，并且免疫细胞更活化。此外，作者通过流式细胞术分离了 12 例 GGN-ADC 样本和等量 SADC 样本的癌细胞和 T 细胞（包括 CD4+ T 和 CD8+ T）， 并通过 qRT-PCR 验证了关键分子的表达。通过综合分析 GGNs 中的细胞表型，我们对肺癌的发生提供了深刻的见解，这将有助于肺癌的预防和治疗。
实验设计
临床样本
scRNA-seq：5 例 GGN-ADCs、5 例 SADCs qRT-PCR：12 例 GGN-ADCs、12 例 SADCs
测序
10x Genomics Single cell 3′ reagent kit v2
数据分析
参考基因组：10x Genomics 提供的 GRCh38-1.2.0 也就是 Ensembl human reference genome GRCh38.84 (dna.primary_assembly) 上游分析流程：Cell Ranger (v.3.0.0) 表达矩阵质控：得到 60,459 个细胞 根据每个细胞的 UMI 数和 Gene 数，去除 范围外细胞 去除线粒体 UMI 比例 > 10 % 的细胞 归一化、标准化、降维及聚类：Seurat 2.3.4 差异表达分析：似然比检验（Likelihood ratio tests） 细胞类型推断：SingleR 包，参考数据集 Human Cell Landscape（http://bis.zju.edu.cn/HCL/index.htmL） 拷贝数变异（CNV）分析：inferCNV 信号通路分析：基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis, GSVA） 转录因子分析：SCENIC 包，motif 数据库 RcisTarget 和 GRNboost
主要结果
GGN-ADC 和 SADC 样本的主要临床数据
平均年龄：GGN-ADC（63.8）vs SADC（65.4） 肿瘤大小：GGN-ADC（1.70 cm）vs SADC（2.54 cm） KI-67（细胞增殖相关）免疫组化分析：GGN-ADC（8.4 %）vs SADC（18.0 %）
scRNA-seq 及细胞类型分析
质控后保留的 60,459 个细胞中，有 34,285 个来自 GGN-ADC，26,174 个来自 SADC。 聚类分析得到 13 群细胞。其中，cluster 5 主要来自 GGN-ADC-1，cluster 10 全部来自 SADC-5，而 cluster 11 来自除 SADC-4 以外的样本，其他 10 个聚类中的细胞则来自所有样本。 根据已知的经典 marker genes 注释细胞分群，包括癌细胞（EPCAM: clusters 2, 5, 10, and 11）、成纤维细胞（COL1A1: cluster 7）、内皮细胞（CLDN5: cluster 9）、T 细胞（CD3D: clusters 0 and 3）、B 细胞（CD79A: cluster 12）、NK 细胞（NKG7: cluster 4）、肥大细胞（MS4A2: cluster 8）以及髓样细胞（LYZ: clusters 1 and 6）。
作者继续划分出了 50 个亚聚类，包括 7 个内皮细胞亚群、5 个成纤维细胞亚群、17 个 T 细胞亚群、3个 B 细胞亚群、4 个 NK 细胞亚群、11 个巨噬细胞亚群、3 个肥大细胞亚群和 13 个癌细胞亚群。在随后的结果中，作者分别对各个亚聚类做了详细阐述。
癌细胞亚群分析：GGN-ADC 中增殖相关通路下调
作者首先解释了根据 EPCAM 注释癌细胞的理由。除了已知的参考文献外，作者通过 CNV 分析发现在 SADC 样本 EPCAM 阳性群的 13 号染色体出现大量缺失；和 CNV 正常的细胞相比，两组样本中的 EPCAM 阳性细胞根据不同的 CNV 模式（扩增或缺失）被分为 9 个 group，在 group 2 中 2 号染色体出现明显扩增。综上，作者推断 EPCAM 阳性群更可能是癌细胞。
接下来就是比较常规的分析了：
13 个癌细胞亚群注释：AT1/AT2 细胞（SFTPC, ABCA3, AGER: clusters 0–5, 7–9, and 11–12）、纤毛细胞（CAPS: cluster 6）和 Clara 细胞（SCGB1A1: cluster 10）。 GSVA：在 GGN-ADC 来源的癌细胞中，Hedgehog 通路、细胞周期、NF-κB 通路、Toll 样受体（Toll-like receptor, TLR）通路和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）通路均下调。 SCENIC：在 GGN-ADC 组中，肿瘤抑制相关的 KLF6 显著上调，而影响增殖、凋亡、免疫细胞激活和基质降解的 EGR1 相关基因显著下调。 差异表达分析显示，与 GGN-ADC 相比 HSPB2、CCL2、CXCL14、MDK 和 MMP7 等促癌基因在 SADC 中显著上调，提示 SADC 比 GGN-ADC 恶性程度更高。
内皮细胞亚群分析：GGN-ADC 中的血管再生相关通路下调
7 个内皮细胞亚群注释：血管内皮细胞（FLT1: clusters 0–3, 5 and 6）、淋巴管内皮细胞（PDPN: cluster 4）。部分细胞还可注释为肿瘤内皮细胞（HSPG2: clusters 0 and 2–6）和正常内皮细胞（MT2A: clusters 0–6）。 正常内皮细胞（主要来自 cluster 1）在 GGN-ADC 组占了绝大多数。 GSVA：PI3K/AKT 通路是 GGN-ADC 组中主要下调的通路，并且其他涉及血管再生的通路诸如 HIF-1 和 VEGF 通路均较 SADC 组下调。此外，氧化磷酸化和代谢相关的通路在 GGN-ADC 中也相对下调。 作者比较了一些血管再生相关基因（VEGFC, MMP2 and HSPG2）和免疫激活相关基因（HLA-E, HLA-DQA2, CCL4 and CXCL2）的表达差异，均提示与SADC 相比 GGN-ADC 组的血管再生受抑制、免疫功能更活跃。话说没有人发现作者的图标反了吗？？？ SCENIC：GGN-ADC 中主要下调 HOXD9 调控的基因，它们和促进癌细胞生长、侵袭和代谢有关。除此之外，免疫细胞激活和分化相关的转录因子诸如 RUNX1 和 SPI1 等调控的基因在 GGN-ADC 中上调。
成纤维细胞亚群分析：GGN-ADC 低表达某些胶原蛋白基因
5 个成纤维细胞亚群（未注释）的 marker genes：GPC3, TINAGL1, COL11A1, PTPRC and KYNU 。 与 SADC 相比，多个胶原蛋白基因（COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL5A2, COL6A3, and COL10A1）在 GGN-ADC 组低表达。 GSVA：在 GGN-ADC 组中，主要下调了氧化磷酸化通路和 cAMP 信号通路，此外还有 Ras-PI3K-mTOR 通路。 SCENIC：GGN-ADC 组主要上调 PPARG（抑制肿瘤进展、代谢和血管再生）而下调 SOX9（促进增殖、抑制凋亡和炎症因子表达）和 EGR3（细胞生长和侵袭）
T 细胞亚群分析：GGN-ADC 来源的 T 细胞激活肿瘤抑制通路
17 个 T 细胞亚群注释：CD8+ T（CD8A: clusters 2, 4, 6 and 9）、CD4+ T（CD4: clusters 0, 2, 3, 5, 8, 10, 11, 14 and 16）和调节性 T（FOXP3: clusters 3, 5, and 11）。部分细胞还可注释为增殖 T （MKI67: cluster 12）和耗竭 T（LAG3: clusters 0–13 and 15）。 差异表达基因：GGN-ADC 组 CD8+ T 细胞下调 KRLB1（抑制细胞毒作用），上调 CD48、GZMK、LY6E 和 IGLC2（CD8+ T 细胞激活和免疫检查点调节） GSVA：在 GGN-ADC 组中： CD8+ T 细胞：主要激活代谢、氧化磷酸化通路，同时还激活抗原递呈相关通路； CD4+ T 细胞：主要抑制 Th17 细胞分化通路，相关的 IL-17 信号通路也下调。另外下调的还有 Th1 和 Th2 细胞分化通路。而 NK 细胞介导的细胞毒作用相关通路则较 SADC 组上调。
B 细胞亚群分析：GGN-ADC 中 B 细胞递呈抗原并触发免疫反应
3 个 B 细胞亚群注释：滤泡 B（MS4A1: cluster 0）、MALT/浆细胞样 B（IGHG1 and JCHAIN: cluster 1-2）。 GSVA：GGN-ADC 中主要上调抗原递呈、抗体分泌和 NK 细胞介导细胞毒作用相关的通路。
NK 细胞亚群分析：GGN-ADC 中的 NK 细胞更有稳健性
4 个 NK 细胞亚群（未注释）的 marker genes：METRNL, GIMAP1, MT1E and KLRC1。 GSVA：GGN-ADC 中上调 Rap1 信号通路、PI3K/AKT 通路、氧化磷酸化、抗原递呈和趋化因子通路等。
髓样细胞和肥大细胞亚群分析：GGN-ADC 中巨噬细胞的 M1 极化
11 个髓样细胞亚群注释：巨噬细胞（CD163: clusters 0 and 1）、朗格汉斯细胞（FCER1A: clusters 2, 4 and 5）、交叉递呈树突状细胞（CLEC9A: cluster 9）和粒细胞（S100A12: cluster 6）。部分细胞还可注释为肿瘤相关细胞（IFITM3: clusters 0–10）和肺相关细胞（RGCC: clusters 0–10）。 3 个肥大细胞亚群（未注释）的 marker genes：VWA5A, KLRB1 and CYBB。 GSVA：在 GGN-ADC 组： 巨噬细胞：主要富集了脂肪消化和吸收相关通路。此外，NF-κB、PI3K/AKT、Notch 信号和 mTOR 信号通路也出现激活，提示巨噬细胞的 M1 极化。 肥大细胞：主要激活趋化因子通路，此外还有 JAK-STAT、PI3K/AKT、Notch、mTOR 信号通路等。与炎性反应相关的血管再生通路也有富集（Rap1、HIF-1 和 VEGF 信号通路）。 差异基因表达：来自 GGN-ADC 的巨噬细胞高表达 M1 极化标记（HLA-DR）、多种促炎症细胞因子如 IL-1 和 TNF-α，以及趋化因子 CCL4。
qRT-PCR 验证
主要验证了癌细胞和 CD8+ T 细胞在两组间差异表达的基因
总结
本文在单细胞水平上刻画了来自 GGN-ADC 和 SADC 肿瘤微环境全面的细胞图谱，包括癌细胞的不同谱系来源，并揭示了两种肿瘤分型在信号通路和转录因子调控方面的差异。总体而言，与 SADC 相比，GGN-ADC 来源的癌细胞恶性程度较低。此外，GGNs 中的内皮细胞和成纤维细胞对肿瘤进展的促进作用更弱，而免疫细胞的抗肿瘤功能相对更活跃。这些结果为了解癌细胞和 TME 的生物学特性和功能提供了数据基础，有助于理解肺癌的发生发展机制以及探寻有效抑制肿瘤进展的关键。
我的评价
又一篇全是套路的单细胞文章。作者先是无监督聚类分出各个细胞大类，然后对各大类进行再分群，每个大类写一个 result，每个 result 里面几乎雷打不动三板斧（降维聚类、GSVA、SCENIC）。作者在分析方法中提到用 SingleR 来推断细胞类型，但在主要结果里似乎没有充分体现这一点，对亚群做阐述时还是相当灵活的，甚至有些亚群不做注释而仅仅描述 marker genes。有一说一，本文作为图谱类文章，数据分析的工作基本还是比较完备的，能写这么多亚群分析的 results 正好说明作者的数据全面捕捉到了肿瘤微环境中的细胞异质性，可能还有挖掘的价值。
从目前来看，我认为单细胞未来的大方向主要有两个：一是多组学，二是解析疾病。而两者都绕不过一个词：整合分析。多组学整合分析自然不必多说。目前随着人类细胞图谱计划的推进，大量描绘正常人体组织细胞异质性的图谱已经产生，这些图谱理论上可以作为研究疾病发生和进展的有用参照，这势必需要将它们和来自患者的数据进行整合。尽管目前有各种整合分析的生信工具被开发出来，但大多数工具主要解决的都是降维、聚类和细胞注释的问题，对于直接跨数据（如疾病-对照）研究差异表达基因（集）一类的问题尚缺乏广泛认可的范式。比起高维数据的处理，这些问题可能更依赖于在统计学上构建比较和检验的模型，以便于处理不同来源的批次效应。