细胞培养实验注意事项

1.这样储存和解冻血清才不会使产品质量受损?

一般情况下建议血清保存在-2O℃。万一一次无法用完一瓶，无菌分装血清放到适当的**容器内，再放回冷冻。

将血清从冷冻箱拿出后，放于2～8℃冰箱使之缓慢融解，一般是融解过夜。

2.血清中包含絮状沉淀，它们是什么，怎么处理?

沉淀主要成分是纤维蛋白和脂蛋白，不会影响血清品质。

让其沉淀在瓶子底部，中上层无沉淀血清直接转出使用，下层血清装到50ml无菌离心管，400g，离心3分钟即可除去 (一般不建议采用过滤的方法除去沉淀，因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤)。

3.实验室如何选择适合的血清?

稀有的澳洲血清培养娇贵细胞(小鼠ES、原代细胞分离培养)，南美血清或国产胎牛血清用于癌细胞、常规细胞系培养(用量大)，新生牛血清用于病毒包装(构建稳转细胞株)。

4.微生物培养基中添加了血清和***后，可长期保存吗?

一旦您在新鲜培养基中添加了血清和***时，您应该在两周内使用它。因为一些***和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

5.有必要做热灭活吗?

实验显示，经过正确处理的热灭**清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或没有作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。若非，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更血清的质量!

6.细胞培养中出现黑点是污染吗?如何处理?

一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成，，要肉眼观察微生物培养基是否混浊，然后，在镜下观察培养细胞生长的状态，黑点是否游动。如果细胞被污染，微生物则会大量繁殖，微生物培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括**污染、支原体污染等。

如果在镜下观察细胞，生长状态良好，与黑点出现前相比，没有变化，那么，黑点的出现可能与以下几种情况有关：

(1)细胞生长过老，破碎的细胞残骸;

(2)血清质量不好，反复冻融的结果;

(3)配制培养基的pH值偏高，不宜细胞生长;

(4)培养原代细胞中出现小黑点，可能是原代组织中的杂质，多次传代可以消除。

7.EDTA在细胞消化过程中起什么作用?

EDTA是一种螯合剂，它可以螯合Ca2+ 或Mg2+，而细胞表面很多和培养皿或培养瓶结合的蛋白都是带有Ca2+ 或Mg2+的，把这些离子螯合后，可以加速细胞和培养皿的脱离，促进消化。上皮类细胞的连接存在“桥粒”结构，是细胞间“牢固”的连接，但桥粒的形成依赖于钙离子的存在。在胰酶消化细胞时，加入EDTA，可以破坏细胞的桥粒结构，使细胞能够分散成单个细胞。通俗地说，就是破坏细胞间的粘连。

8.如何选用特殊细胞系培养基?

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。选DMEM做贴壁细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养。另外还可以参考ATCC网站的推荐信息。

9.怎样让细胞适应新的条件?

从原条件逐渐过度：1/4、1/2、3/4，后是新培养基。

10.为何微生物培养基保存于4℃，颜色会偏暗红色?

1.培养基内之CO2会逐渐溢出，造成微生物培养基越来越偏碱性。颜色也会随碱性增加而更偏暗红。

2.培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。需调整pH值至~7.2.

11.细胞冻存管应如何解冻?

37℃，1~2分钟内全部融解。

冷冻管建议放在液氮液面上面，由液氮桶中取出解冻时，注意安全(戴护目镜)，预防冷冻管之爆裂。

12.细胞冻存管应如何解冻?

可能原因：

(1)胰蛋白酶消化过度

(2)支原体污染

(3)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当

(4)细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)

(5)接种细胞起始浓度太低或太高

解决办法：

(1)缩短消化时间或降低胰蛋白酶浓度

(2)如发现支原体污染，及时丢弃培养物。

(3)重新配置消化液或培养液

(4)复苏新的保种细胞

(5)调节佳接种细胞浓度