小鼠毛发生长和休止期时皮肤中的分子学机制
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摘 · 要
测序皮肤稳态由不同细胞类型和干细胞更新、细胞系定型、分化。小鼠皮肤相关的单细胞测序也有不少了。但是，一个系统的皮肤全层分析图谱还没有个清晰的认识。文章主要应用单细胞转录组测序和mRNA-FISH确定皮肤细胞在毛囊生长期和休止期的基因表达特性和空间定位。文章确定了55个细胞亚群，其中毛囊外根鞘（ORS）和内层毛囊结构有新发现。
测序对象
样本：雌性C57BL/6，取处于生长期的（5周龄，n=3）和休止期（9周龄，n=2）的小鼠背部皮肤，做单细胞测序。
分选：HBSS +0.04% BSA悬浮皮肤，切成1mm宽的小条， 0.2%胶原酶，37℃，1h。挤压，70um过滤，HBSS +0.04% BSA洗 ----主要是基质细胞，冰上保存；未消化部分，0.05% trypsin‐EDTA for 15 minutes at 37°C，挤压，70um过滤，主要是表皮细胞。离心后分别再次用40um过滤。
测序分析
方法
使用的是Chromium Single Cell 3’kit (version1; 10X Genomics)；Illumina HiSeq2500.生长期小鼠，p5w ，测3149个细胞， 休止期， p9w 测得2618个细胞
数据
CellRanger package (v1.1.0; 10X Genomics)处理数据，数据存储在GSE129218，2020年4月1号公布，分析过程、代码在文章发表后以jupyter notebook的形式公布。
聚类方法（两种）
标准的seurat
单细胞测序聚类的金标准 ----来确定皮肤里主要的细胞群，分成7个大群，文中称为1st level clusters.
使用clustering with affinity propagation （AP）----用来看特定细胞群的亚群，发现有55个亚群，文中称为2nd level clusters.
（补充：AP算法的基本思想是将全部样本看作网络的节点，然后通过网络中各条边的消息传递计算出各样本的聚类中心。聚类过程中，共有两种消息在各节点间传递，分别是吸引度( responsibility)和归属度(availability) 。AP算法通过迭代过程不断更新每一个点的吸引度和归属度值，直到产生m个高质量的Exemplar（类似于质心），同时将其余的数据点分配到相应的聚类中。由于AP算法不适用均值做质心计算规则，因此对于离群点和异常值不敏感；同时其初始值不敏感的特性也能保持模型的较好鲁棒性。这两个突出特征使得它可以作为K-Means算法的一个有效补充，但在大数据量下的耗时过长，这导致它的适用范围只能是少量数据；虽然通过调整damping（收敛规则）可以在一定程度上提升运行速度（damping值调小），但由于算法本身的局限性决定了这也只是杯水车薪。详见：https://www.dataivy.cn/blog/%E8%81%9A%E7%B1%BB%E7%AE%97%E6%B3%95affinity-propagation_ap/ ）
数据分析
文章使用了很多分析方法如：细胞群变化算法(自定义)， 细胞群中差异基因的表达、基于keratin的表达预测细胞特性（自定义），RNA velocity分析（使用velocyto 包）
看生长期、休止期细胞亚群的变化
（这部分很值得借鉴，FigS1D）
作者自己使用了一套计算方法，比较复杂，详见文中Test of statistical enrichment in anagen or telogen skin部分。
作者鉴定出毛囊外根鞘(ORS)部分，作者define了三个细胞群。三个细胞群分别是：
Msx2 expression（占比大）
Barx2 expression（文中称此亚群为OL1）
Il11ra1 expression（文中称此亚群为OL2）
其中细胞亚群2和3没有被报道过，紧接着，文章主要对这三个细胞群做了研究分析。
1. Msx2 expression cells显示出从祖细胞的中央群分支的不同谱系的特征。
RNA velocity图：
normalization by total expression was performed after selecting genes (min_expr_counts = 10, min_expr_counts_U = 1, min_cells_express_U = 1), kNN imputation was then performed in PCA space ('matrix’: k = 100, n_components = 15) and gammas were fitted using weights = 'maxmin_diag'. Genes were filtered based on minR2 ≥ 0.2 and min_gamma ≥ 0.01. RNA velocity was subsequently estimated assuming constant velocity and transition probability as well as embedding shift were calculated based on the previously generated UMAP representation of the anagen dataset (transform = "log", n_sight = 500 ('all’,’matrix’) or 100 ('ORS’), sigma_corr = 0.1). The Markov models were created using similar steps as presented in the (La Manno et al., 2018) paper.
说明的是：
Msx2+细胞被分成GL,IRS,MED,CX这四个亚群，GL 这个亚群又可以分化成IRS,MED,CX这三个亚群，且Markov model又说明了 IRS4/6, CX5 and MED2/3 就是分化终点。这些结果说明，Msx2+细胞中的GL亚群，不表达任何分支的signature, 且是transcriptionally uncommitted.
【背景知识】
生长期的毛囊微观上有7层同心圆结构
the companion layer (Cp), three layers of the inner root sheath (IRS: Henle (He), Huxley (Hu), IRS cuticle (Icu)), and the cuticle (CU), cortex (CX) and medulla (MED) layers that form the new hair shaft (Fuchs, 2007)
2. 细胞亚群Barx2 expression（文中称此亚群为OL1），Il11ra1 expression（文中称此亚群为OL2）
做了个FISH 检查其在毛囊中的定位，如下图，同层和不对称内部结构展示出OL-细胞特性
为确定这两层OL细胞的异质性，进一步分群，各分出3个亚群
OL1
OL2
其他细胞群
作者大概分析了一下，没有什么特别新的发现，作者推测可能是测序深度的问题。
皮肤fibroblast（7个群）
生长期时，SF1, DS2, 富集，SF2完全消失
休止期时，DS1富集
为了确定fibro的空间分布，用四个marker来Dcn, Gpx3, Sparc and Plac8分群
表皮细胞群
表皮细胞的聚类分出亚群，和之前的分群一致。
IFE, upperHF，SG，outer bulge，这次没有inner bulge and cornified layer keratinocyte
新增了 CD34-，Id+细胞，可能与secondary hair germ of telogen HF
基因表达差异为：
生长期，induced gene主要集中在代谢过程，包括 Intermediate metabolism (Oat, Pkm, Tpi1, Dbi1), energy metabolism (Ndufa4l2, Ucp2), Mitochondrial function (mt-‐Cytb), and protein synthesis.生长期，HF Barx2,Dbi,and Ucp2上调，Cd34 and Ftl1下调
休止期，上调的基因主要是，metallothionins (Mt1 and Mt2),and differentiation markers, such as Sfn
免疫细胞群
免疫细胞,以下六个群休止期、生长期没有明显变化，（有报道小亚群有变化）
T细胞：Cd3e,Thy1,Nkg7
DC细胞:Cd209a,Cd74
LC细胞：Cd207，Mfeg8
MC1：Ccl6,C1qa, Cd209f
MC2：Ccl6，Lyz1
MC3：Ccl6, Ly6c2, Emilin2
总结
本文分析工作做的比较细致、深入。作者主要制定了毛囊休止期、生长期，全层皮肤的细胞组成全景图。主要发现了ORS两个新的细胞亚群，且其中的matrix cell（Msx2+细胞）是transcriptionally uncommitted。系统的比较了休止期和生长期，对于其中skin stroma的研究也带来新视野。